Der Einfluß von TGF-beta1 auf das Wachstum und die Differenzierung von humanen Gelenkchondrozyten im zwei- und dreidimensionalen Zellkulturmodell

Abstract

Die Behandlung von Knorpeldefekten, vermehrt an Hüfte und Knie, nimmt derzeit in der orthopädischen Chirurgie einen immer größeren Stellenwert ein. Es werden mehrere Therapiemöglichkeiten angeboten, die alle primär zum Ziel haben beim Patienten Schmerzen und Entzündungen zu reduzieren und seine Bewegungsfähigkeit wieder herzustellen. Besonderes Augenmerk richtet sich dabei zunehmend auf die sogenannte autologe Chondrozyten Transplantation (ACT), bei der dem Patienten Knorpelzellen entnommen, im Labor vermehrt und ihm schließlich zur Defektdeckung wieder reimplantiert werden. Mit Hilfe dieses Tissue Engineering werden eine Reihe von Verfahren verwendet, um die Knorpelzellen zu vermehren. Im Rahmen dieser Arbeit werden zwei Modelle eingesetzt, die sogenannte Monolayer- und die dreidimensionale Alginatkultivierung. Weiterhin wird als Wachstums- und Differenzierungsfaktor TGF-beta1 in unterschiedlichen Konzentrationen beigegeben, um dessen Einfluß auf die Kultivierung von Chondrozyten zu untersuchen. Die Transkription des osteoblastären Differenzierungsfaktors Cbfa1 wird als Maß für die Neigung der Chondrozyten zu einer Transdifferenzierung (Umwandlung in Osteoblasten) bestimmt. Humane Gelenkchondrozyten von 17 Patienten wurden nach der Methode von Brittberg (1995) aus Operationspräparaten isoliert und die so gewonnenen Chondrozyten mit DMEM/ Ham´s F12 K Medium, 20% FKS und 1% Penicillin/ Streptomycin im Kulturschrank bei einer Atmosphäre von 5% CO² bei 37°C kultiviert. Es wurden auf Alginat basierende 3D-Kulturen einmal als Kontrollgruppe und mit 0,1 ng/ml und 0,01ng/ml TGF-beta1 angelegt. In regelmäßigen Abständen wurde mittels quantitativer rt-PCR (PE Biosystems 7700) die Expression des Cbfa1 gemessen. Die Bestimmung der Expression erfolgte im Verhältnis zum Housekeeping Gen HPRT. Innerhalb der Studie konnte in drei Passagen ein Einfluß von TGF-beta1 auf die Cbfa1 Expression gezeigt werden. Während bei den ohne TGF-beta1 behandelten Proben Cbfa1 signifikant anstieg, konnte bei den TGF-beta1 Proben eine sichtbar geringere Expression nachgewiesen werden. Die in dieser Studie in vitro beobachtete Regulation des Cbfa1 unter Einfluss von TGF-beta1 zeigt, daß es möglich ist, die Dedifferenzierung (Plastizität) von Chondrozyten zu einem mehr osteoblastärem Phänotyp zu unterdrücken und so die chondrale Differenzierung weitgehend zu erhalten. In Zusammenhang mit weiteren Wachstumsfaktoren bietet dieses Verfahren eine Möglichkeit für die Erzeugung differenzierter Knorpelzelltransplantate. Diese können so schneller kultiviert werden. Gleichzeitig wird die osteoblastäre Umdifferenzierung verlangsamt. The treatment of cartilage damages, especially in the hip and knee joint, becomes more and more important in orthopaedic surgery. Several therapeutic options are available, all of them aiming to reduce pain and inflammation and to restore the patients mobility. Special attention is increasingly drawn to the so-called autologous chondrocyte transplantation (ACT): cartilage cells are taken from the patient, cultured and reimplanted to cover the cartilage defect. Among the methods of Tissue Engineering several ways exist to culture cartilage cells. In this study we used two models: the so-called monolayer- and the three-dimensional alginate culture. The growth- and differentiation factor TGF-beta1 was added in different concentrations to study its influence on the culture of chondrocytes. The rate of transcription of the osteoblastic differentiation factor Cbfa was measured to establish the tendency of transdifferentiation (transformation to osteoblasts) of the chondrocytes.Human articular chondrocytes taken from 17 patients were isolated from samples obtainted at joint surgery as described by Brittberg (1995). The chondrocytes were cultured in DMEM/Ham´s F12 K medium supplemented with 20% FCS and 1% penicillin/streptomycin at an atmosphere of 5% CO² at 37°. Alginate based 3D cultures with added 0.1 ng/ml / 0.01 ng/ml TGF-beta1 were used for the control group. The expression of Cbfa1 was measured within regular intervals by means of quantitative rt-PCR (PE Bio Systems 7700). The extent of the expression was determined in proportion to the Housekeeping gene HPRT. An influence of TGF-beta1 on the Cbfa1 expression was shown within 3 passages. While the samples not treated with TGF-beta1 showed a significant increase of Cbfa1, a significant decrease was shown within the TGF-beta1 samples. This study explored the regulation of Cbfa1 under the influence of TGF-beta1 in vitro and showed that it is possible to suppress the dedifferentiation (plasticity) from chondrocytes to a more osteoblastic-like phenotype and to preserve the enchondrale differentiation in this way. In combination with certain growth factors this method offers a possibility to produce highly differentiated cartilage cell transplants. These can be cultivated faster, whereas osteoblastic differentiation is slowed down simultaneously.