Die essentielle Bedeutung des "Classical Transient Receptor Potential 6" (TRPC6)-Ionenkanals für die akute vaskuläre Hypoxiereaktion der Lunge : Untersuchungen an isolierten pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen

Abstract

Die Hypoxische Pulmonale Vasokonstriktion (HPV) ist eine physiologische Antwort der Lunge auf alveoläre Hypoxie, bei der die Perfusion des Blutes zur Optimierung des Gasaustausches an die Ventilation angepasst wird. Dieser erstmals 1946 durch von Euler und Liljestrand postulierte Regulationsmechanismus ist hinsichtlich Sauerstoffsensor- und Signaltransduktionsweg noch nicht umfassend geklärt. Untersuchungen an isolierten pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen (PASMC) zeigen einen Hypoxie-induzierten Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i) und eine darauf folgendeKontraktion. Dies weist auf eine Funktion der PASMC sowohl als Sensor- als auch als Effektorzelle für die HPV hin. Darüberhinaus wird aber auch eine Rolle des Endothels durch Freisetzung von vasokonstriktiv wirkenden Substanzen wie Endothelin-1 (ET-1) imZusammenhang mit der HPV diskutiert. Dabei scheint die akute Phase der HPV (Dauer:Sekunden bis Minuten) endothelunabhängig und die protrahierte Phase der HPV (Dauer:Stunden) endothelabhängig zu sein. Zur Untersuchung der HPV auf der Ebene der PASMC wurde in der vorliegenden Arbeiteine geeignete Zellisolierungs- und Meßmethodik für PASMC der Ratte etabliert. Die Zellen wurden dabei insbesondere aus dem präkapillären Bereich derintrapulmonalarteriellen Gefäße gewonnen. Bei der Charakterisierung der kultivierten Zellen mittels der Immunofluoreszenzmethode zeigte sich für die Passagen P0, P1 und P3 eine positive Färbung für die für glatte Muskelzellen typischen Proteine alpha-Aktin und die schweren Ketten des Myosins. Endothelzellen konnten durch eine fehlende Färbung gegen den von Willebrand Faktor ausgeschlossen werden. Untersuchungen mittels des Western-Blots zeigten keinen Unterschied bezüglich der Menge des alpha-Aktins und der schweren Ketten des Myosins bei einem Vergleich zwischen P1 und P3, was auf einen Erhalt des kontraktilen Zustands im Zuge der Kultivierung der PASMC hinwies. Als geeigneteMessmethodik für die Untersuchung der Hypoxieantwort stellte sich die Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration [Ca2+]i mittels Fura-2 heraus. Ein Vergleich der Reaktion der PASMC von P0, P1 und P3 auf ET-1 als positiven Stimulus ergab eine Abnahme des transienten Anstiegs der [Ca2+]i mit zunehmender Passage. Deshalb wurden alle darauffolgenden Experimente mit nicht-passagierten PASMC (= Passage 0) durchgeführt. Zur Schaffung der hypoxischen Bedingungen für die Untersuchung der Hypoxieantwort der PASMC wurde ein Perfusionssystem etabliert. In einem zweiten Schritt erfolgte die Übertragung der Zellisolierung und der [Ca2+]i-Messtechnik von Ratten auf Maus PASMC, da dies auch die Untersuchung von PASMC aus gendefizienten Mäusen ermöglichte. Da frühere Untersuchungen auf eine wichtige Rolle der Rezeptor-aktivierbaren, nicht-selektiven klassischen transient receptor potential TRPC-Kanäle für die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen hinweisen und TRPC6 eine essentielle Komponente der Rezeptor-operierten Ca2+-durchlässigen nichtselektiven Kationenkanäle in den glatten Muskelzellen ist, wurde die Bedeutung der TRPC6-Kanäle für die Hypoxieantwort untersucht. Dabei zeigte sich, dass PASMC von Wildtyp (WT)-Mäusen, aber nicht von TRPC6-/--Mäusen unter Hypoxie mit einem Anstiegder [Ca2+]i reagierten. Alle Messungen erfolgten nach Sensibilisierung der PASMC mit ET-1. Dieser Anstieg der [Ca2+]i wurde im Wesentlichen durch den Einstrom von Ca2+-Ionen aus dem Extrazellulärraum durch spannungsabhängige L-Typ Ca2+-Kanäle (VOCC) bewirkt, da die Inhibition derselben mittels Nicardipin einen Anstieg der [Ca2+]i verhinderte. Im Gegensatz zu den VOCC sind TRPC6-Kanäle auch für andere Kationen als Ca2+durchlässig. Untersuchungen mittels der Mn2+-Quench-Methode zeigten für PASMC der WT-Mäuse einen größeren Hypoxie-induzierten Mn2+-Einstrom als für PASMC derTRPC6-/--Mäuse, das auf einen Hypoxie-induzierten Kationen-Einstrom durch TRPC6-Kanäle hinweist. Aus früheren Untersuchungen ist bekannt, dass in Anwesenheit von extrazellulären Na+-Ionen der Kationeneinwärtsstrom durch TRPC6-Kanäle hauptsächlich durch Na+-Ionen und nur zu einem geringen Prozentsatz (ca. 4%) durch Ca2+-Ionen verursacht wird. Dies führt zu der Hypothese, dass die durch den Na+-Ioneneinstrom verursachte Membrandepolarisierung möglicherweise unter Inhibition von spannungsabhängigen Kalium (KV)-Kanälen einen Ca2+-Einstrom durch VOCC bewirkt. Da sowohl die Anreicherung von Diacylglycerol (DAG) durch Inhibition der DAG-Kinase mittels des DAG-Kinase Inhibitors R59949 als auch t-BHP (tertiäres Butyl-Wasserstoffperoxid) einen Anstieg der [Ca2+]i nur in WT, aber nicht in TRPC6-/--PASMC unter Hypoxie bewirkte, und im Rahmen der HPV besonders ROS (Reaktive Sauerstoffspezies) wie O2-. und H2O2 als Mediatoren diskutiert werden, scheint die TRPC6-Aktivierung unter Hypoxie durch eine ROS-vermittelte DAG-Akkumulation verursacht zu werden. Um dies genauer aufschlüsseln zu können, wäre einerseits die Messung der zellulären DAG-Konzentration und andererseits die Ermittlung der genauenRolle von ROS unter Hypoxie ein wichtiges Ziel für weitere Untersuchungen. Hypoxic pulmonary vasoconstriction (HPV) is a physiological response of the lung to alveolar hypoxia that machtes blood perfusion with ventilation to optimize pulmonary gas exchange. Although this mechanism was first described by von Euler and Liljestrand in 1946, the underlying oxygen sensing and signal transduction processes have not been fully elucidated. Investigations with isolated pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMC) have demonstrated that hypoxia induces an increase in the intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) of PASMC with subsequent cell contraction. This suggests that PASMC are the sensor as well as the effector cells of HPV. In addition, a role for the endothelium in HPV is discussed in the context of the release of vasoactive substances such as endothelin-1(ET-1). However the acute phase of HPV (duration: seconds to minutes) seems to be endothelium-independent, while the sustained phase of HPV (duration: hours) is endothelium-dependent. In the present study, a technique for investigation of HPV at the level of PASMC was developed. Cells were isolated from the precapillary region of the intrapulmonary arteries. The cultured cells from passages P0, P1 and P3 were characterized by immunofluorescence and exhibited positive staining for the typical smooth muscle proteins alpha-actin and myosin heavy chain. Endothelial cells were excluded by a negative staining for von Willebrand factor. Investigations by Western blot indicated no quantitative differences in alpha-actin and myosin heavy chain levels between P1 and P3, which pointed to a maintenance of the contractile state of the PASMC in culture. Measurement of [Ca2+]iusing fura-2 proved to be a useful technique for the investigation of the response to hypoxia. A comparison of the response of PASMC from P0, P1 and P3 to ET-1 indicated a decrease in the transient elevations in [Ca2+]i with the number of passages. Therefore, all experiments were performed with non-passaged PASMC (= passage 0). To ensure hypoxic conditions for the investigation of the PASMC response to hypoxia, a perfusion system was established. In a second step, the cell isolation- and [Ca2+]i-imaging-technique was transferred from rat to mouse cells, because PASMC from gene deficient mice could then be investigated. Since previous investigations suggested a possible role of receptor-operated non-selective classical transient receptor potential (TRP)-channels for the regulation of the tonus of smooth muscle cells, and TRPC6 as an essential component of receptor-operated nonselective cation-channels in smooth muscle cells, the importance of TRPC6-channels for Anhang 112the response to hypoxia was investigated. Here PASMC from wild type (WT)-mice, but not from TRPC6-/--mice indicated an increase in [Ca2+]i under hypoxic conditions. All measurements were performed after sensitization of the PASMC with ET-1. This increase in [Ca2+]i was caused primarily by Ca2+-entry from the extracellular space through voltagedependent L-type Ca2+-channels (VOCC), because the inhibition of VOCC by nicardipin prevented an increase in [Ca2+]i.In contrast to VOCC, TRPC6-channels are also permeable for other cations other than Ca2+. Investigation by Mn2+-quenching indicated a larger hypoxia-induced Mn2+ influx for PASMC from WT-mice than for PASMC from TRPC6-/--mice, demonstrating a hypoxiainduced cation influx through TRPC6-channels. It is kown from previous investigations,that in the presence of extracellular Na+-ions the cation inward-current through TRPC6-channels is mainly caused by Na+-ions and only for a small percentage (~ 4%) by Ca2+.Thus it can be hypothesized that the membrane depolarization caused by Na+-influx results in a Ca2+-entry through VOCC possibly involving the inhibition of voltage-dependent potassium (KV)-channels. Since diacylglycerol (DAG) accumulation by DAG-kinaseinhibition using the DAG-kinase inhibitor R59949 as well as tert-butylhydroperoxide (t-BHP) resulted in an increase of [Ca2+]i in WT but not in TRPC6-/- PASMC under hypoxia, and reactive oxygen species (ROS) like O2-. and H2O2 are discussed as mediator of HPV, the activation of TRPC6 under hypoxia appears to be caused by a ROS-mediated DAG accumulation. In order to get more detailed information about this it would be necessary to measure the DAG-concentration and to investigate the concrete function of ROS under hypoxia.