Die apoptotischen Endonukleasen Endonuklease G und Deoxyribonuklease IIalpha : Heterologe Expression, Reinigung und biochemische Charakterisierung

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Teilprojekte behandelt, die beide zur Aufklärung der strukturellen Natur der aktiven Spezies der apoptotischen Endonukleasen Endonuklease G (EndoG) und Desoxyribonuklease IIalpha (DNase IIalpha), beitragen sollten. Aus Säugerzellen gewonnene bovine EndoG wurde zuvor bereits weitgehend biochemisch charakterisiert und für das Protein ein Homolgiemodell erstellt. Zu dessen Verifikation wäre es notwendig, Kristallstruktur- oder NMR-spektroskopische Analysen durchzuführen. Um dafür geeignete Proteinpräparationen herzustellen, sollte EndoG in E. coli überexprimiert und gereinigt werden. Da EndoG dabei in inclusion bodies abgelagert wird, wurden in diesem Teil der Arbeit mehrere biochemische Strategien angewandt um aktive EndoG in löslicher Form oder durch Renaturierung aus inclusion bodies zu gewinnen. Expression von EndoG als Fusion mit dem löslichkeitsfördernden Protein NusA führte zu dem Ergebnis, dass sowohl das Fusionsprotein, als auch EndoG nach Abspaltung von NusA durch Thrombin zwar löslich, aber inaktiv waren. In anderen Ansätzen gelang es immerhin durch den Einsatz von Detergenzien in Verbindung mit dem künstlichen Chaperon beta-Cyclodextrin lösliche EndoG aus inclusion bodies zu erhalten, aber keine Präparation des Enzyms verfügte über zufrieden stellende Nukleaseaktivität. Auch ein Matrix-basierter Rentaurierungsversuch unter Verwendung des iFOLDTM-Systems mit 92 verschiedenen, empirisch ermittelten Renaturierungspuffern brachte hier nicht den gewünschten Erfolg. Zur Charakterisierung des aktiven Zentrums von humaner lysosomaler DNase IIalpha sowie der Beantwortung der Frage, ob die aktive Spezies dieses Enzyms eine dimere oder monomere (pseudodimere) Struktur aufweist, wurde im zweiten Teilprojekt dieser Arbeit nach erfolgreicher Etablierung eines Expressionssytems in Säugerzellen eine alanine scanning Mutagenese des Enzyms durchgeführt. Es wurden solche Aminosäurereste gegen Alanin ausgetauscht, die in den vorgeschlagenen Modellen, zu den postulierten N- und C-terminalen PLD-Motiven HxK xn-N-xn-(E/Q/D) gehören. Die Ergebnisse des alanine scannings weisen stark darauf hin, daß das katalytische Zentrum der humanen DNase IIalpha von zwei PLD-Motiven gebildet wird, und die aktive Spezies folglich ein Monomer bzw. Pseudodimer ist. Gelfiltrationsanalysen sowie Coimmunopräzipitationsassays mit unterschiedlich Epitop-fusionierten DNase IIalpha-Varianten lieferten darüber hinaus zusätzliche Hinweise auf eine pseudodimere Struktur der aktiven DNase IIalpha. This thesis involved two projects that were to give insight into the structural nature of the apoptotic Endonucleases EndoG and DNase IIalpha. Bovine EndoG that was gained from mammalian cells has already been extensively biochemicaly characterized and a homology model for the protein has been made. To verify the model it would be necessary to do crystal structure- or NMR-spectroscopic analyses. To produce Protein preparations that are suited for such investigations, EndoG was to be overexpressed in E. coli and then purified. As an overexpression of EndoG in E. coli leads to the protein being deposited in inclusion bodies, several biochemical strategies were utilized to overcome this problem and gain active EndoG in a soluble form. The expression of EndoG fused to the solubility enhancing protein NusA lead to the result that both, the fusionprotein as well as EndoG by itself, after cleaving off NusA with thrombin, were soluble but inactive. Another strategy, involved the use of a combination of detergents and an artificial chaperone, namely beta-Cyclodextrin and lead to preparations of soluble EndoG that lacked satisfactory nuclease activity. A matrix-based renaturing method (the iFOLDTM-System) which includes 92 empirically acquired refolding buffers also yielded soluble EndoG in an inactive form. The second part of the thesis, dealt with the human lysosomal DNase IIalpha. After having established an expression/purification system in mammalian cells an alanine scanning mutagenesis was performed. Those amino acid residues that, according to presented models, belong to the N- and C-terminal PLD-motifs HxK xn-N-xn-(E/Q/D) were exchanged to alanine. Then the active site of the enzyme was characterized and the question whether the active DNase IIalpha is a monomer (pseudodimer) or a dimer was addressed. The results of the alanine scanning strongly support the theory that the DNase IIalpha is a pseudodimer with two PLD motifs in one polypeptide chain that together form an active site. Additionally gelfiltration- and coimmunoprecipitation-assays using different epitope tags were done to investigate the monomer-dimer status of DNase IIalpha. The resulting data also support the theory that the DNase IIalpha is a pseudodimer.