Multiparametrische Analyse der Oozyten-, Zygoten- und Embryoqualität im humanen IVF-Programm

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde im Rahmen eines In-vitro-Fertilisations-Programmes beim Menschen die Struktur der inneren der drei Schichten der Zona pellucida aller 1058 gewonnenen Oozyten aus 103 Behandlungszyklen mit intrazytoplasmatischer Spermieninjektion analysiert. Die Analyse der Struktur erfolgte dabei mittels Polarisationsmikroskopie (Polscope) an vitalen Oozyten. Die Verschiebung der Schwingungsebene zirkular polarisierten Lichtes beim Durchgang durch die Zona pellucida lässt sich dabei als sogenannter Retardancewert ausdrücken, der eine qualitative Analyse der Zonastruktur erlaubt. Die Zona pellucida ist während der Oogenese eng mit der Oozyte assoziert. In diesem Zusammenhang sollte die Frage bearbeitet werden, ob die Struktur der inneren Schicht der Zona pellucida einen neuen Parameter der Oozytenqualität darstellt. Aus diesem Grunde wurden mögliche Zusammenhänge zwischen der Retardance der inneren Zonaschicht und weiteren Parametern der Oozyten-, Zygoten- und Embryoqualität sowie einigen patienten- und stimulationsspezifischen Parametern untersucht. Aufgrund der großen Varianz der Retardancewerte der Oozyten sowohl im Vergleich verschiedener Behandlungszyklen als auch innerhalb eines Zyklus wurden alle potentiellen Zusammenhänge sowohl unter dem Aspekt der durchschnittlichen Retardance aller untersuchten Oozyten ("Interkohortenanalyse", Ret) als auch unter dem Aspekt der Einordnung der Oozyte in den Zusammenhang ihrer Eizellkohorte ("Intrakohortenanalyse", deltaRet) ausgewertet. Es konnte gezeigt werden, dass der genomische Reifegrad der Oozyten signifikant mit der Struktur der inneren Zonaschicht korellierte. Unreife Oozyten zeigten dabei erhöhte Retardances der inneren Zonaschicht. Dabei verändert sich die Zonastruktur im Verlauf der in-vitro-Kultur nicht mehr, im Gegensatz zur genomischen Reifung der Oozyten, die in-vitro weiter fortschritt. Dadurch war es mittels der Messung der Zonaretardance möglich, ursprünglich unreife, dann aber im Zeitintervall zwischen Retardanceanalyse und Insemination nachgereifte Oozyten zu erkennen. Aufgrund dieses Ergebnisses wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Zonaretardance einen Marker zytoplasmatischer Reife darstellt, da sie zunächst mit der genomischen Reife korrelierte, sich im weiteren Kulturverlauf aber nicht mehr veränderte. Die genomische Reifung unreifer Oozyten lief hingegen in Kultur weiter ab, so dass bei solchen Oozyten eine Entkopplung der zytoplasmatischen und genomischen Reife vermutet wurde. Diese Hypothese wurde durch die Tatsache unterstützt, dass die Retardance der inneren Zonaschicht (Ret und deltaRet) häufig derart mit Parametern der Oozyten-, Zygoten- und Embryoqualität assoziert war, dass eine höhere Retardance mit einer schlechteren Qualität einherging. Statistisch signifikante Zusammenhänge konnten zwischen der Retardance der inneren Zonaschicht und der Fertilisierungsrate der untersuchten Oozyten, der Morphologie der Pronuklei der fertilisierten Oozyten, weiterer Parameter der Zytoplasmamorphologie der Zygoten sowie dem Fragmentierungsgrad der Embryonen 40 Stunden nach Insemination demonstriert werden. Weiterhin wurden tendenzielle Zusammenhänge zwischen der Retardance der inneren Zonaschicht und dem Alter der Frau, sowie der für die kontrollierte ovarielle Hyperstimulation im Rahmen der IVF-Behandlung administrierten Dosis humanen menopausalen Gonadotropins deutlich. Die Retardanceanalyse der im Rahmen einer In-vitro-Fertilisation gewonnenen Oozyten kann somit als eine neue, zusätzliche Methode gewertet werden, die es erlaubt, Oozyten mit großem Entwicklungspotenzial zu identifizieren. Dabei ist für die Auswahl individueller Eizellen aus der Kohorte eines Behandlungszyklus die Analyse der Retardance individueller Oozyten im Vergleich zu den weiteren Oozyten der gleichen Kohorte (Intrakohortenanalyse) von wesentlicher Bedeutung. In the present study the structure of the innermost of the three human zona pellucida layers was analysed in 1058 vital oocytes retrieved in 103 treatment cycles in a routine IVF-program. Structural analysis of the zona was done by polarized light microscopy (Polscope). The shift of the plane of circular polarized light during passage through the zona pellucida can be expressed as the so called Retardance value which in turn allows a quantitative analysis of the zona structure. During oogenesis the zona pellucida is closely associated to the oocyte. In this context, the aim of the present study was to investigate if the structure of the innermost zona layer could be utilized as a new marker of oocyte quality. Therefore, we examined possible correlations between the retardance value of the inner zona layer and further parametres of oocyte-, zygote- and embryo quality as well as several patient- and stimulation dependent parametres of ART-cycles. Remarkable variance of the inner layer retardances both, comparing oocytes from different treatment cycles and oocytes originating from one individual treatment cycle was found.Due to this fact, every correlation was evaluated with respect to the average retardance of the total number of the examined oocytes ("Intercohortanalysis", Ret) as well as to the retardances of the oocytes from every individual cycle ("Intracohortanalysis", deltaRet). It could be shown that the genomic maturity of oocytes correlated significantly with the zona pellucida inner layer shortly after retrieval. Immature oocytes showed high retardances of the inner layer. Zona structure did not change during the first 18 hours of in-vitro culture in contrast to genomic maturation which went on in-vitro. This result made it possible to identify originally immature but subsequently matured oocytes in the time intervall between retardance analysis and insemination via ICSI. This result leads to the hypothesis that the zona innermost layer retardance may be used as a marker of cytoplasmic maturity of the oocytes because initially retardance correlates with genomic maturity and does not change during culture. In contrast, genomic maturity of the oocytes improved during culture, possibly leading to a decoupling of cytoplasmic and genomic maturity. This hypothesis may be supported by the fact that higher inner layer retardances were negatively associated with several parametres of oocyte-, zygote- and embryo quality. Statistically significant correlations were found between the zona pellucida inner layer retardance and

fertilization rate morphology of pronuclei of zygotes several parametres of zygote cytoplasmic morphology fragmentation rate of embryos 40 hours post insemination. Furthermore, correlations between the inner layer retardance and age of patient dose of administered human menopausal gonadotropinebecame apparent, though did not reach statistical significance. The analysis of the retardance of the innermost layer of the zona pellucida of oocytes retrieved during an in-vitro-fertilization cycle can be rated as a new, additional method to identify oocytes with a high developmental potential. Of high importance at this is the evaluation of the zona inner layer retardance of an individual oocyte in comparison to the retardance of the other oocytes retreaved from the same cycle ("Intracohortanalysis"). Only this consideration allows the appropriate use of the retardance analysis as a tool for the selection of high potential oocytes out of an oocyte pool retrieved in an ART-cycle.