In vivo siRNA-Transfektion der Lunge und des Bronchialkarzinoms zur Analyse der Hypoxie-induzierbaren Faktoren in der Tumorprogression

Abstract

Die Arbeit befasste sich mit der Etablierung der in vivo siRNA-Transfektion der Lunge und von zwei Lungentumormodellen in der Maus. Ein Lungentumormodell wurde durch die intratracheale Instillation von Lewis-Lung-Karzinomzellen der Maus etabliert (LLC-Modell). Als weiteres Lungentumormodell wurde das subkutane Xenograftmodell durch die subkutane Injektion von humanen Adenokarzinomzellen verwendet (A549-Modell). Bei diesem Modell konnte die Tumorprogression durch direkte Messung des Tumorvolumens einfach verfolgt werden. Es diente insbesondere dazu, durch die Inhibition der Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF-1alpha und HIF-2alpha) deren Rolle für die Tumorprogression zu analysieren. Nach intratrachealer Verabreichung fluoreszenzmarkierter siRNA mit Lipofectamine 2000 an der gesunden Maus war das Lungengewebe nicht transfiziert. Nur luftgefüllte Bereiche der Alveolen und einige Makrophagen (identifiziert durch Durchflusszytometrie) zeigten positive Signale der fluoreszenzmarkierten siRNA. Im LLC-Modell waren nur einige Makrophagen nach intratrachealer siRNA Verabreichung positiv, während das Tumorgewebe negativ war. Bei Verwendung eines weiteren Transfektionsreagenz (in vivo jetPEI ) überlebten die Tiere nach intratrachealer Applikation nicht. Somit erwies sich die intratracheale Verabreichung der siRNA mit den genannten Transfektionsagentien als ungeeignet für die Lunge und das LLC-Modell. Nach intravenöser Verabreichung fluoreszenzmarkierter siRNA über einen Rechtsherzkatheter war die Lunge mit Lipofectamine 2000 und in vivo jetPEI zu transfizieren. Insbesondere zeigten sich positive Signale in der Gefäß- und Bronchuswand und in Zellen der Alveolarsepten. Auch im LLC-Modell zeigten sich bei dieser Form der Verabreichung positive Signale der fluoreszenzmarkierten siRNA. Vor allem gefäßnahe Tumorbereiche und kleine Tumoren zeigten starke Signale. Eine fünffache Dosiserhöhung der siRNA komplexiert mit in vivo jetPEI ergab keine weitere Steigerung der Transfektionseffizienz. Die intravenöse Verabreichung der siRNA über einen Rechtsherzkatheter erwies sich somit als geeignet zur Transfektion der Lunge und des Tumorgewebes im LLC-Modell. Die intraperitoneale Verabreichung von siRNA mit in vivo jetPEI im A549-Modell zeigte starke Signale der fluoreszenzmarkierten siRNA im Tumorgewebe, während andere untersuchte Organe bei dieser Verabreichungsform nicht transfiziert waren. Dieses Verfahren wurde eingesetzt, um HIF-1alpha und HIF-2alpha zu inhibieren. HIF-1alpha und HIF-2alpha konnte im Tumor durch geeignete siRNA (si-HIF-1alpha und si-HIF-2alpha) inhibiert werden. Die Suppression von HIF-1alpha und HIF-2alpha wurde auf mRNA-Ebene durch Real Time RT-PCR von RNA aus Tumorextrakten nachgewiesen. Es zeigte sich jeweils eine signifikante Reduktion der HIF-1alpha oder HIF-2alpha mRNA im Vergleich zu den mit siRNA-ran-(Kontrolle) behandelten Tumoren. Der Effekt von siRNA-HIF-1alpha und siRNA-HIF-2alpha auf die Tumorprogression wurde außerdem über einen Zeitraum von fünf Wochen im Vergleich zu siRNA-ran-behandelten Tieren untersucht, hierbei wurden die siRNAs zweimal wöchentlich verabreicht. Die siRNA-HIF-2alpha-behandelten Tumoren zeigten ein signifikant reduziertes Wachstum im Vergleich zur Kontrolle, während siRNA-HIF-1alpha keine signifikante Änderung des Tumorwachstums aufwies. Die Tumoren wurden histologisch weitergehend charakterisiert. Bei den siRNA-HIF-2alpha-behandelten Tumoren zeigte sich eine signifikante Reduktion der Angiogenese gemessen durch die Anzahl der Mikrogefäße, sowie eine signifikante Hemmung der zellulären Proliferationsrate, während die Apoptoserate im Vergleich zur Kontrolle signifikant gesteigert war. Bei den siRNA-HIF-1alpha-behandelten Tumoren zeigte sich keine signifikante Änderung der Angiogenese und Apoptoserate, während die zelluläre Proliferationsrate signifikant reduziert war. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Transfektion synthetischer siRNA in vivo möglich ist, und insbesondere die Lunge über den Rechtsherzkatheter für siRNA erreichbar ist. Des Weiteren zeigte diese Arbeit, dass die siRNA-Technik, in vivo eingesetzt, Untersuchungen zur Genfunktion bei der Tumorprogression zulässt. Insbesondere wurde gezeigt, dass HIF-2alpha eine entscheidende Rolle in der Progression und Angiogenese von Adenokarzinomen der Lunge spielt und somit ein viel versprechendes Ziel für therapeutische Ansätze bietet. In this study in vivo siRNA transfection procedures for the lung and for two lung tumour mouse models were analyzed and established. One lung tumour model was initiated by intratracheal instillation of lewis-lung-carcinoma cells of mouse (LLC-model). The other xenograft lung tumour model was initiated by subcutaneous injection of human adenocarcinoma cells (A549-model). This model which allowed direct measurement of the tumour size was applied for analysis of the role of the hypoxia-inducible factors (HIF-1alpha and HIF-2alpha) in tumour progression. After intratracheal administration of fluorescence labelled siRNA complexed with Lipofectamine 2000 to the healthy mouse, no transfection of the lung tissue was observed. Only airfilled areas of the alveoli and some macrophages (identification by flow cytometry) displayed positive signals. Also, in the LLC-model only some macrophages were positive after intratracheal siRNA administration, whereas the tumour tissue showed no staining of fluorescence labelled siRNA. Employing in vivo jetPEI as a further transfection agent, the mice did not survive after its intratracheal application in complex with siRNA. Thus, intratracheal administration of siRNA with the two transfection agents appeared not to be appropriate for the lung and the LLC-model. After intravenous injection of fluorescence labelled siRNA by right heart catheter, the lung was transfectable employing both Lipofectamine 2000 and in vivo jetPEI as transfection agents. Particularly, positive signals were observed in vessels, bronchi, and in cells from the alveolar septum. Also, in the LLC-model positive signals of fluorescence labelled siRNA were observed using this administration way. Particularly, tumour areas adjacent to vessels and small tumours displayed strong signals. A fivefold increase of the siRNA in complex with in vivo jetPEI did not further increase signal intensity. Intravenous injection of siRNA by right heart catheter thus represented a successful technique for siRNA transfection of lung and tumour tissue in the LLC-model. After intravenous injection of fluorescence labelled siRNA by right heart catheter, the lung was transfectable employing both Lipofectamine 2000 and in vivo jetPEI as transfection agents. Particularly, positive signals were observed in vessels, bronchi, and in cells from the alveolar septum. Also, in the LLC-model positive signals of fluorescence labelled siRNA were observed using this administration way. Particularly, tumour areas adjacent to vessels and small tumours displayed strong signals. A fivefold increase of the siRNA in complex with in vivo jetPEI did not further increase signal intensity. Intravenous injection of siRNA by right heart catheter thus represented a successful technique for siRNA transfection of lung and tumour tissue in the LLC-model. Intraperitoneal injection of siRNA with in vivo jetPEI in the A549 model demonstrated strong signals of the fluorescence labelled siRNA in the tumour tissue whereas other studied organs appeared to be non transfected. This route was applied for the inhibition of HIF-1alpha and HIF-2alpha in the A549-model. Both, HIF-1alpha and HIF-2alpha could indeed be suppressed by the specific siRNA sequences. Suppression of HIF-1alpha and HIF-2alpha were proven on mRNA level by realtime RT-PCR from RNA extracts of the tumour tissues, which revealed significant reduction of HIF-1alpha and HIF-2alpha in comparison to siRNA-ran treated control tumours. Additionally, the effect of siRNA-HIF-1α and siRNA-HIF-2alpha on tumour progression was studied over a time period of five weeks. The siRNAs targeting HIF-1alpha;, or HIF-2alpha or the siRNA control were injected twice per week. Interestingly, tumours treated by siRNA-HIF-2alpha demonstrated a significant reduced tumour growth when compared to control, whereas siRNA?HIF-1alpha showed no significant alteration of tumour growth. The tumours were further characterized histologically. In siRNA-HIF-2alpha treated tumours a significant reduction of angiogenesis as measured by counting of microvessels was observed. Also, a significant inhibition of proliferation was noticed whereas apoptosis was significantly enhanced when compared to the control group. In siRNA-HIF-1alpha treated tumours no change of angiogenesis and apoptosis was observed, whereas proliferation was significantly reduced.Taken together, it could be shown that transfection of synthetic siRNA in vivo is possible and particularly the lung is accessible by right heart catheter. Furthermore this study demonstrated that siRNA applied in vivo allows studies about the gene function with respect to tumour growth. Particularly, it was shown that HIF-2a plays a critical role in progression and angiogenesis of adenocarcinomas of the lung and provides a promising approach or therapeutic intervention.