Immunmodulatorische Wirkung und pathogenetische Bedeutung der Escherichia coli Shigatoxine beim Rind

Abstract

Persistent mit Shigatoxin-bildenden Escherichia coli (STEC) infizierte Rinder sind das wichtigste Reservoir für Infektionen des Menschen mit humanpathogenen STEC-Stämmen (sog. enterohämorrhagischen E. coli [EHEC]). Eine erfolgreiche Prävention humaner EHEC-Infektionen muss deshalb die Bekämpfung der STEC im Rind zum Ziel haben. Zur Entwicklung wirksamer Massnahmen fehlte bisher das Verständnis der Persistenzmechanismen. Mit den Shigatoxinen (Stx) verfügen die STEC über die Fähigkeit zur Hemmung der Proliferation peripherer boviner Lymphozyten. Eine immunsupprimierende Wirkung der Toxine könnte zur Persistenz der STEC-Infektion beitragen. Um diese Hypothese zu überprüfen, sollte der Mechanismus der Stx-bedingten Immunmodulation aufgeklärt, Zielzellen für Shigatoxine in der Darmschleimhaut des Rindes identifiziert und die pathophysiologische Wirkung der Toxine in vitro und in vivo bestimmt werden. Die strukturelle Aufklärung des funktionellen Stx1-Rezeptors auf peripheren Lymphozyten zeigte, dass die Wirkung des Toxins durch das Glykosphingolipid Globotriaosylzeramid (Gb3 syn. CD77; Gal(alpha1-4)Gal(1-4)Glc(1-1)zeramid) vermittelt wurde. Dieses damit beim Rind erstmalig beschriebene Leukozytenantigen wurde von Lymphozyten in vitro und in vivo aktivierungsabhängig exprimiert. Dabei existierten verschiedene Isoformen des Gb3/CD77, die aufgrund unterschiedlicher Fettsäuren im Membran-verankerten Teil der Moleküle in ihrer Affinität für Stx1 differierten. Stx1-bindende Isoformen wurden von peripheren Lymphozyten insbesondere zu Beginn der Aktivierung exprimiert. Die Proliferationshemmung durch Stx1 betraf insbesondere CD8alpha-positive T-Zellen und B-Zellen. Sie manifestierte sich ohne Auslösung von Zelltod und wurde auch von der enzymatisch inaktiven, die Rezeptor-Bindung vermittelnde B-Untereinheit (StxB1) induziert. Die Wirkung wurde nicht durch Zytokine wie IL-2, IFN-gamma oder TNF-alpha vermittelt, sondern beruhte auf einer direkten Einwirkung des Shigatoxins 1 auf Lymphozyten in frühen Aktivierungsstadien. Dies lässt vermuten, dass Shigatoxine nicht generell immunsuppressiv wirken, sondern frühzeitig die Entwicklung einer Antigen-spezifischen Immunität behindern können. Tatsächlich entwickelte sich eine systemische zelluläre Immunität gegen STEC-Antigene nach Infektionen von Kälbern mit einem Stx2-bildenden EHEC O157:H7 Stamm nur signifikant verzögert. Zusätzlich wirken Shigatoxine aber auch unmittelbar auf die lokale Immunabwehr der bovinen Darmschleimhaut. Bovine Granulozyten exprimierten, auch wenn sie auf eine Schleimhaut-Oberfläche migriert waren, keine Stx-Rezeptoren und waren gegenüber Stx1 resistent. Mit Subpopulationen von Kolonepithelzellen und mit Makrophagen-artigen Zellen konnten allerdings Zielzellen für Stx1 identifiziert werden, die sich bei der Kolonisation der bovinen Darmschleimhaut in unmittelbarer Nähe zu den STEC-Kolonien befinden. Diese Zellen widerstanden ebenfalls der zytoletalen Wirkung des Shigatoxins 1, reagierten jedoch auf das Toxin mit der vermehrten Transkription bestimmter Chemokin-Gene. Vor allem Lymphozyten stellen aber in der Schleimhaut Zielzellen für Stx1 dar. Bei der Analyse intraepithelialer Lymphozyten (IEL) ex vivo exprimierten überwiegend reife, aktivierte CD3+CD8alpha+-T-Zellen Gb3/CD77. Nach Inokulation von Darmschlingen bei Kälbern mit einem Stx1-bildenden O103:H2 Stamm verschob sich im Vergleich zu Kontrollschlingen, die mit einer isogenen Deltastx1-Mutante des Stammes inokuliert worden waren, innerhalb von 12 Stunden die Zusammmensetzung der IEL zulasten dieser Subpopulation. In vitro blockierte Stx1 bereits im Nanogramm-Konzentrationsbereich die Stimulierbarkeit der IEL. Im Gegensatz zu den Subpopulationen peripherer Lymphozyten unterschieden sich die IEL-Subpopulationen nur geringfügig in ihrer Empfindlichkeit gegenüber der aktivierungshemmenden Wirkung des Shigatoxins 1. Darüberhinaus waren bereits wenige Stunden nach Internalisierung enzymatisch aktiven Stx1-Holotoxins in IEL, nicht aber in PBMC, il-4-Transkripte signifikant häufiger nachweisbar. Die Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass Shigatoxine bei der enteralen STEC-Infektion von Rindern über Glykolipid-Rezeptoren immunmodulatorisch wirken. Die Rezeptoren dienen dabei nicht nur der Internalisierung des Holotoxins, sondern scheinen nach Toxinbindung auch Signale von der Zelloberfläche zu vermitteln. Im Gegensatz zur immunstimulierenden Wirkung anderer bakterieller Toxine, die als Glykolipid-Rezeptor-Agonisten wirken, und auch im Gegensatz zur zytoletalen und pro-inflammatorischen Wirkung der Shigatoxine beim Menschen, steht beim Rind die immunsuppressive Wirkung der Shigatoxine im Vordergrund. Dies könnte das Fehlen von klinischen Erscheinungen bei bovinen STEC-Infektionen ebenso erklären wie den persistierenden Charakter der Infektion. Damit eröffnen diese Ergebnisse neue Möglichkeiten zur Entwicklung effizienter Massnahmen zur Bekämpfung dieser humanpathogenen Erreger beim Rind. A considerable number of cattle is persistently infected with Shigatoxin-producing Escherichia coli (STEC) and thereby represents a source of infections of man with human pathogenic STEC strains (syn. enterohemorrhagic E. coli [EHEC]). Intervention strategies to effectively prevent human EHEC infections must be aimed at the limitation of bovine STEC infections, therefore. The mechanisms that form the basis of the persistence are poorly understood. By secreting Shiga toxins (Stxs) STEC are capable of inhibiting the proliferation of peripheral bovine lymphocytes. It is tempting to speculate that an immunosuppressive activity of these toxins contributes to the persistence of STEC infections in cattle. In an attempt to prove this hypothesis the objectives of the studies were to elucidate the mechanism of the Stx-induced immunomodulation, to identify target cells for Stxs in the bovine intestinal mucosa, and to determine the pathophysiological activity of the toxins in vitro and in vivo. Structural analysis of functional Stx1-receptors on peripheral lymphocytes revealed that the effect of the toxin was mediated by the glycosphingolipid globotriaosylceramide (Gb3 syn. CD77; Gal(alpha1-4)Gal(1-4)Glc(1-1)ceramide). This leukocyte antigen, newly discovered in cattle, was expressed by lymphocytes in vitro and in vivo in an activation-dependent fashion. Evidence is provided for the existence of different isoforms of Gb3/CD77 that differed in their affinity for Stx1. These differences were based on differences in the fatty acids incorporated in the membrane-anchored part of the Gb3/CD77 molecules. Stx1-binding isoforms were expressed by peripheral lymphocytes predominantly at early stages of the activation process. The Stx1-induced inhibition of proliferation mainly affected CD8alpha-positive T-cells and B-cells. This effect occurred independently of cellular death and was induced as well by the enzymatically inactive B-subunit (StxB1) responsible for receptor binding. The effect of Stx1 was not mediated via cytokines as IL-2, IFN-gamma, or TNF-alpha but required the direct impact of Stx1 on lymphocytes at early activation stages. These findings let to assume that Stxs have the potency to hinder the development of an antigen-specific immunity in cattle rather than being generally immunosuppressive. In fact, the development of a systemic cellular immune response specific for STEC antigens was significantly retarded in calves experimentally infected with a Stx2-producing EHEC O157:H7 strain. Furthermore, Stx1 was found to directly act on the local immune response in the bovine intestinal mucosa. Bovine granulocytes lacked Stx-receptors even after the cells had migrated to a mucosal surface and the cells proved to be resistant to Stx1. However, subpopulations of colonic epithelial cells and macrophage-like cells, presumably residing in the bovine mucosa in proximity to STEC colonies, were identified as target cells for Stx1. These cells resisted the cytolethal effect of Stx1 but responded to the toxin by an elevated transcription of certain chemokine genes. Still, lymphocytes appear to be the most important target cells for Stx1 in the mucosa. When intraepithelial lymphocytes (IEL) were analysed ex vivo Gb3/CD77 was predominantly expressed by mature, activated CD3+CD8alpha+ T-cells. Accordingly, inoculation of ligated intestinal loops in calves with a Stx1-producing O103:H2 strain led within 12 hours to a small but significant reduction in this IEL subpopulation when compared to loops inoculated with an isogenic Deltastx1-mutant to that strain. In vitro, Stx1 inhibited the mitogenic responsiveness of IEL in the nanogram concentration range. In contrast to subpopulations of peripheral lymphocytes, IEL subpopulations only marginally differed in their sensitivity to the activation-inhibiting activity of Stx1. Furthermore, significantly more il-4-specific transcripts were detected in IEL but not in peripheral lymphocytes a few hours after internalisation of the enzymatically active Stx1 holotoxin. The results support the hypothesis that, during bovine STEC infections, Stxs act as immunomodulators via glycolipid receptors. The receptors are not only required for the internalisation of the holotoxins but also appear to mediate signals from the cell surface upon toxin binding. Different from the immunomodulatory activities of other bacterial toxins acting as glycolipid-receptor agonists, and in contrast to the cytolethal and pro-inflammatory activity of Stxs in humans, the Stxs principally act as immunsuppressive virulence factors in cattle. These findings might explain both, the lack of clinical symptoms in the course of bovine STEC infections as well as the persistent character of the infection. The immunosuppressive capacity of the Stxs should be considered during the development of effective strategies ought to lower the magnitude and frequency of shedding by cattle of these human pathogenic bacteria.