Die Rolle des ungewöhnlichen response Regulators FrzZ im Lebenszyklus des Bodenbakteriums Myxococcus xanthus

Abstract

Das Gram-negative Bodenbakterium Myxococcus xanthus zeichnet sich durch ein hoch entwickeltes Sozialverhalten aus. Dies wird besonders in der kooperativen Jagd auf Beute-Organismen, sowie der Bildung vielzelliger Fruchtkörper bei Nährstoffmangel deutlich. Eine essentielle Grundlage dieser komplexen Lebensweise stellt das Gleiten der Zellen über feste Oberflächen dar. Diese Bewegung basiert auf den genetisch unterschiedlichen Systemen der A (adventurous) und S (social) Motilität, wobei eine gerichtete Bewegung durch die regulatorische Funktion des frz-Signaltransduktionssystems vermittelt wird. Die Komponenten dieses Systems weisen Ähnlichkeit zu den Proteinen enterobakterieller Chemotaxissysteme auf, zeigen aber auch einige auffällige Unterschiede. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, spezifische Aspekte der Signalweitergabe durch das frz-System zu klären. Im Mittelpunkt stand der response Regulator FrzZ, welcher zwei CheY-ähnliche Domänen vereint und als ausführende Komponente des Systems dient. Die durchgeführten Analysen ermöglichten ein detailierteres Bild der Funktionsweise des ungewöhnlichen Proteins. So konnte zunächst die Hypothese einer phosphorylierungsabhängigen Aktivierung von FrzZ untermauert werden. Das Vorhandensein einer funktionellen Domäne erwies sich dabei als essentiell für die Aktivität des response Regulators, während die volle Funktionsfähigkeit nur durch die Präsenz beider Domänen erreicht wurde. In diesem Zusammenhang konnte ebenfalls gezeigt werden, dass sich die Funktion der beiden Domänen von FrzZ in der Regulation der Zellbewegung voneinander unterscheidet. Weiterhin implizierte die immunologische Analyse fraktionierten Zellextraktes auch in M. xanthus die Bildung von Rezeptor-Signal-Komplexen, wie man sie aus chemotaktischen Organismen kennt. Es konnte gezeigt werden, dass eine Kolokalisierung von FrzZ mit diesen Komplexen vom Vorhandensein der Kinase des frz-Systems FrzE abhängig ist, aber auch durch die Ser/Thr-Phosphatase Pph1 beeinflusst wird. Die Analyse einer möglichen Wechselwirkung von FrzZ mit der Phosphatase stellte einen weiteren Punkt der vorliegenden Arbeit dar. Die durchgeführten in vitro Interaktionsanalysen konnten keine direkte Wechselwirkung der beiden Proteine bestätigen. Dennoch deutet die Komplementation der Defekte pph1-defizienter Zellen durch die Expression verschiedener, durch Mutagenese veränderter Formen des FrzZ-Proteins, sowie der Phänotyp der konstruierten Doppelmutante auf eine Positionierung beider Proteine in einem Signalweg hin. Als weiterer möglicher Interaktionspartner des response Regulators konnte ein Protein identifiziert werden, das sich durch den Besitz von sechs TPR-Motiven (tetratricopeptide repeats) auszeichnet. Diese kennt man sowohl aus prokaryontischen als auch aus eukaryontischen Proteinen, wo sie an der Organisation von Multiproteinkomplexen beteiligt sind und Protein-Protein-Interaktionen vermitteln. Die Inaktivierung des korrespondierenden Gens führte zu einem charakteristischen Phänotyp, dessen Analyse eine verstärkte Bildung von Typ IV Pili (TFP) auf den Zelloberflächen bestätigte. Dieser Effekt konnte auch in einer pilC-Punktmutante, nicht aber in einer pilC-Deletionsmutante beobachtet werden, was auf eine Wechselwirkung dieser beiden Proteine, in Form einer Inhibition von PilC durch TPR, hindeutet. Da das PilC-Protein an der TFP-Assemblierung beteiligt ist, wurde daraufhin ein Modell postuliert, das eine Möglichkeit der Regulation des sozialen Gleitens durch FrzZ vorschlägt, in welchem TPR die Interaktionsbasis einer Wechselwirkung des response Regulators mit PilC bietet. The gram-negative soil bacterium Myxococcus xanthus is characterized by its highly sophisticated social behaviour. This becomes particularly obvious in the cooperative prey on other bacteria as well as the formation of multicellular fruiting bodies upon nutrient depletion. Gliding over solid surfaces is crucial for that lifestyle under all conditions. In M. xanthus this movement depends on the genetically distinct systems of A (adventurous) and S (social) motility and is directed by the frz-chemosensory system. This signal transduction pathway is formed by proteins that share significant homology with chemotaxis proteins from enteric bacteria, but also possess some striking differences. The aim of this work was to resolve some of the specific aspects of signal transduction through the frz-system. The performed analyses focused on the FrzZ Protein, an unusual response regulator composed of two CheY-like domains, resuming an output of the system. Complementation analyses in an frzZ-negative background strongly indicated a phosphorylation dependent activation of the protein. Moreover the presence of one functional domain of FrzZ turned out to be crucial for activity of the response regulator whereas unlimited functionality was only observed by the presence of both domains. In this regard it could also be shown that the two domains of FrzZ function differently in controlling motility. Furthermore immunological analysis of fractionated cell extracts implicated the formation of receptor-signalling-complexes known from chemotactic organism, in M. xanthus as well. Colocalization of FrzZ with these complexes could be shown to depend on the presence of the kinase of the frz-system FrzE, but also to be influenced by the Ser/Thr phosphatase Pph1. Analyzing the potential interaction of FrzZ with that phosphatase was another aim of the present work. In vitro interaction analyses using the purified proteins could not verify a direct interaction of FrzZ and Pph1. Complementation of the defects of pph1-deficient cells by expression of differently mutagenized FrzZ forms, as well as the phenotype of the constructed doublemutant however point to a localization of the two proteins in the same signalling pathway. As another potential interaction partner of FrzZ a protein was identified, containing six TPR-motifs (tetratricopeptide repeats). These motifs are known from prokaryotic as well as eukaryotic proteins to coordinate multiprotein-complexes and to mediate protein-protein-interactions. Inactivation of the corresponding gene led to a characteristic phenotype caused by the overproduction of type IV pili (TFP) on the cellular surface. This effect was also observed in a pilC-pointmutant but not in a pilC-in frame deletion mutant, indicating an inhibition of PilC by TPR in vivo. As the PilC-protein is involved in TFP assembly, this finding led to a model of FrzZ regulating social motility in vivo by the use of the TPR-protein to interact with PilC.