Functional analysis of RACK1 as a novel interaction partner of BMPRII in pulmonary arterial hypertension

Abstract

Die Pulmonalarterielle Hypertonie (PAH) ist charakterisiert durch eine selektive Erhöhung des pulmonalarteriellen Blutdrucks. Das pathologische Korrelat der PAH ist ein Verschluss der pulmonalen Arteriolen durch eine Proliferation/Fehlfunktion der glatten Gefässmuskelzellen und des Endothels. Heterozygote Keimbahnmutationen im Bone Morphogenetic Receptor Type II (BMPRII) kodierenden Genlokus zeigen eine Assoziation mit PAH, was für einen Einfluss des BMPRII auf die Pathogenese der PAH spricht. Um die Funktion von BMPRII zu charakterisieren, war es das Ziel unserer Arbeit, neue potentielle Interaktionspartner dieses Rezeptors mittels Yeast Two-Hybrid Analyse zu identifizieren. Unter den vielen bisher unbekannten Interaktionspartnern von BMPRII wurde RACK (receptor for activated protein kinase C)-1 für weitergehende Untersuchungen ausgewählt. Glutathion S-Transferase (GST)-pulldown Experimente sowie Ko-Immunopräzipitationen bestätigten die Interaktion von RACK1 und der BMPRII Kinasedomäne. Immunohistochemische Analysen von Lungenschnitten und Immunofluoreszenzanalysen isolierter glatter Muskelzellen aus der Pulmonalarterie zeigten eine Ko-Lokalisation von BMPRII und RACK1 in vitro und in vivo. Für weitere funktionelle Analysen wurde das RACK1 Gen kloniert und in einem BMP-Reportergenassay überexprimiert. RACK1 Expression führte zu einer zweifach erhöhten Reportergenaktivität nach BMP-2 Stimulation, was einen synergistischen Einfluss der BMPRII-RACK1 Interaktion auf die BMP Signalkaskade zeigt. Dieser Befund wird durch die Tatsache unterstüzt, dass die Depletion von RACK1 mittels small interfering RNA (siRNA) Technologie zu einer verstärkten Proliferation von glatten Gefässmuskelzellen der A. Pulmonalis führt, was für eine regulatorische Rolle von RACK1 auf das Zellwachstum spricht. Mehrere BMPRII Varianten, welche aus dem internationalen PAH Patientenpool stammen, zeigten eine reduzierte Affinität für RACK1. Im Tiermodell der durch Monokrotalin induzierten pulmonalen Hypertonie wurde eine signifikant erniedrigte Expression von RACK1 auf RNA und Proteinebene gefunden. Die vorliegende Arbeit beschreibt daher einen funktionell bedeutenden Einfluss der neu identifizierten Interaktion zwischen BMPRII und RACK1 auf die BMP Signaltransduktion. Die reduzierte Affinität von RACK1 für BMPRII Varianten und die erniedrigte RACK1 Expression im Tiermodell der pulmonalen Hypertonie sprechen für einen bedeutenden Einfluss von RACK1 und der RACK1-BMPRII Interaktion auf die Pathogenese der PAH. Pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterised by selective elevation of pulmonary arterial pressure. The pathological hallmark of PAH is the occlusion of pulmonary arterioles due to proliferation and dysfunction of smooth muscle and endothelial cells. Heterozygous mutations in BMPR2, encoding the type II BMP receptor (BMPRII), were identified in PAH suggesting that alterations to BMPRII function are involved in disease onset and/or progression. To further elucidate the function of BMPRII, we sought to identify novel interaction partners of BMPRII by yeast two-hybrid analysis using the kinase domain of BMPRII as a bait. Using this technology, several novel interaction partners of BMPRII were identified. Among these, the receptor for activated protein kinase C (RACK)-1 was selected for further investigation. The interaction between RACK1 and the BMPRII kinase domain was confirmed by Glutathione S-transferase (GST)-pull-down and co-immunoprecipitation. Immunofluorescent staining of human pulmonary artery smooth muscle cells (paSMC), as well immunohistochemistry of human lungs from healthy donors and PAH patients, demonstrated the co-localisation of BMPRII and RACK1 in vitro and in vivo. Overexpression of RACK1 in paSMC led to a two-fold increase in induction of a BMP-responsive promoter in a luciferase-based promoter reporter assay, indicating that the BMPRII-RACK1 interaction may potentiate BMP signalling. RACK1 depletion using small interfering RNA (siRNA) technology resulted in enhanced proliferation of paSMC, thus implicating a role for RACK1 and the RACK1-BMPRII interaction in paSMC growth regulation. In contrast, overexpression of RACK1 led to enhanced proliferation of paSMC. Several BMPRII variants that contained amino acid substitutions present in PAH patients exhibited a reduced affinity for RACK1. Furthermore, in the monocrotaline-induced rat model of PAH, the expression of RACK1 was significantly down-regulated at the RNA and protein level, two and four weeks after monocrotaline administration. Thus, the novel interaction of RACK1 with BMPRII is functionally significant in BMP signal transduction. The reduced affinity of RACK1 for BMPRII variants that are peculiar to PAH patients, and the reduced levels of RACK1 evident in the pulmonary vasculature in an animal model of PAH, suggest a potential role for RACK1, and the RACK1-BMPRII interaction, in the pathogenesis of PAH.