Interactions of glycoconjugates from the parasitic trematode Schistosoma mansoni with C-type lectins

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die Interaktionen von Glykokonjugaten, hauptsächlich Glykolipiden, des Humanparasiten Schistosoma mansoni mit den humanen C-typ Lektinen DC-SIGN (dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin) und L-SIGN (liver/lymph node specific ICAM-3-grabbing nonintegrin) untersucht. Da DC-SIGN bereits im frühen Stadium der Infektion als Pathogenrezeptor fungiert, wurden Glykolipide aus S. mansoni Cercarien, den humaninfektiösen Larven, isoliert und deren Kohlenhydratanteile enzymatisch freigesetzt. Nach Auftrennung dieser Glykane durch verschiedene HPLC Techniken wurden die resultierenden Fraktionen mittels MALDI-TOF-MS charakterisiert. Aus Glykanen, die das Lewis X [Galbeta1-4(Fucalpha1-3)GlcNAc] oder das pseudo-Lewis Y Epitop [Fucalpha1-3Galbeta1-4[Fucalpha1-3]GlcNAcbeta-] tragen, wurden Neoglykolipide durch reduktive Aminierung an einen Lipidanker synthetisiert. Verschiedene Bindungsstudien mit rekombinantem, chimärem DC-SIGN-Fc und humanen dendritischen Zellen (DCs) zeigten, dass diese beiden Kohlenhydratepitope von DC-SIGN gebunden werden. Somit ist das schistosomenspezifische pseudo Lewis Y Motiv der erste pathogenspezifische Ligand welcher für DC-SIGN entdeckt wurde. Durch molekulares Modellieren konnte gezeigt werden, dass zur Bindung von pseudo Lewis Y die Orientierung der Seitenkette der Aminosäure Phe313 in der secondary binding site von DC-SIGN leicht geändert werden musste, was jedoch in einer energetisch optimalen Bindung von Phe313 mit der hydrophobe Seite der an die Galaktose gebundenen Fucose des pseudo-Lewis Y resultierte. Daher wurde postuliert, dass Pathogene wie S. mansoni diese, auch von anderen Autoren beobachtete Flexibilität in der secondary binding site von DC-SIGN, nutzen, um mit DCs zu interagieren, was zur Immunmodulation beitragen könnte. Des Weiteren konnte das Vorkommen von Lewis X und pseudo-Lewis Y Epitopen auf Glykolipiden, welche aus den exkretorischen/sekretorischen (E/S)- Produkten von Cercarien gewonnen wurden, aufgezeigt werden, was die Rolle dieser beiden Epitope in der Immunmodulation durch S. mansoni unterstreicht. L-SIGN, das zweite untersuchte humane C-Typ Lektin, fungiert als Antigenrezeptor auf humanen sinusoidalen Endothelzellen der Leber (liver sinusoidal endothelial cells; LSECs). Da insbesondere die Eier von S. mansoni stark immunogen und ein Hauptauslöser der Th2 Immunantwort sind, interessierte uns, in wiefern deren Kohlenhydrate, vorliegend als Glykoproteine oder Glykolipide, in der schistosomenspezifischen Immunantwort beteiligt sind, und welche Kohlenhydratepitope von L-SIGN gebunden werden. Die gewonnenen Daten belegen, dass L-SIGN sowohl Glykoproteine aus löslichen Eiantigenen (SEA, soluble egg antigens) als auch Glykolipide aus Eiern bindet. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass von L-SIGN gebundenes SEA auch in die Zelle internalisiert wird. Nach Behandlung von SEA mit Endoglykosidase H, welche oligomannosidische N-Glykane ( high-mannose type ) abspaltet, waren jedoch keine Bindung an L-SIGN und folglich keine Internalisierung von SEA in L-SIGN- exprimierenden Zellen mehr beobachtbar. Im Gegensatz dazu wurde durch Flusssäure (HF) defucosyliertes SEA weiterhin von L-SIGN exprimierenden Zellen gebunden und vergleichbar schnell wie unbehandeltes SEA in diese Zellen internalisiert. Demzufolge bindet L-SIGN SEA nicht über ein fucosyliertes Epitop, sondern über oligomannosidische N-Glykane. Parallel zu den Glykoproteinen aus SEA wurden auch Glykolipide aus S. mansoni Eiern auf ihre Ligandenspezifität zu L-SIGN untersucht. Dazu wurden Glykolipide aus Eiern isoliert und über Kieselgelsäulen chromatographisch aufgetrennt. Die resultierenden Glykolipidfraktionen wurden in Bindungsstudien mit L SIGN-exprimierenden Zellen eingesetzt. Diese führten zu dem Ergebnis, dass L SIGN nur eine Glykolipidfraktion bindet. Diese enthält zahlreiche fucosylierte Spezies mit der massenspektrometrisch bestimmten allgemeinen Zusammensetzung Hex1HexNAc5& #8722;7dHex3& #8722;6Cer. Mit dieser Glykolipidfraktion durchgeführte Methylierungsanalysen zur Klärung der Kohlenhydratverknüpfungspositionen sowie Tandem Massenspektrometrie und molekulares Modellieren zeigten, dass die Bindung von L-SIGN zu dieser Glykolipidfraktion am nicht reduzierenden Ende der Kohlenhydratkette das F-LDN-F Tetrasaccharid [Fucalpha1-3GalNAcbeta1-4(Fucalpha1-3)GlcNAc] als minimalen Liganden benötigt. Die L-SIGN gain of function Mutante Ser363Val, welche auch fucosylierte Lewis Antigen erkennt, bindet jedoch diese F-LDN-F enthaltene Glykolipidfraktion nicht. Dies führte zu der Vermutung, dass L-SIGN über verschiedene Bindungsmodi für Fucosen in Ei Glykolipiden (F-LDN-F) und Fucosen in Lewis Antigenen verfügen muss. Zusammengefasst zeigen diese Daten zu L-SIGN, dass dieses Lektin sowohl oligomannosidische N-Glykane als auch fucosylierte Kohlenhydratepitope innerhalb der Schistosomen Eiantigene erkennt. Dies zeigt, dass L-SIGN zwar ein breites, aber zugleich auch ein kohlenhydratepitopspezifisches Ligandenprofil besitzt. Es ist bemerkenswert, dass zwei biochemisch so ähnliche und hoch konservierte C-Typ Lektine wie DC-SIGN und L-SIGN dennoch in ihrer Ligandenspezifität variieren, welches in dieser Arbeit aufgezeigt werden konnte. Weitere Studien sind nötig, um die Funktionen dieser beiden Lektine innerhalb der vielfältigen Möglichkeiten, wie parasitische Glykane die Immunantwort des Wirtes beeinflussen können, aufzuklären. In this thesis the interactions of glycoconjugates, mainly glycosphingolipids, of the parasitic helminth Schistosoma mansoni with the human C-type lectins DC-SIGN (dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin) and L-SIGN (liver/lymph node specific ICAM-3-grabbing nonintegrin) have been investigated. Since DC-SIGN is known to act as a pathogen recognition receptor at an early stage of infection, glycolipids of cercariae, the human infectious larvae, have been isolated, and the glycan moieties have been released enzymatically. After separation into single glycan species via HPLC and subsequent structural characterization, neoglycolipids, carrying either Lewis X [Galbeta1-4(Fucalpha1-3)GlcNAc]or pseudo-Lewis Y [Fucalpha1-3Galbeta1-4[Fucalpha1-3]GlcNAcbeta-] epitopes, were attached to a synthetic lipid anker by reductive amination. Solid phase assays using a recombinant chimeric DC-SIGN-Fc and binding studies with dendritic cells revealed that both carbohydrate species are recognized by DC-SIGN. Hence, pseudo-Lewis Y is the first parasite-specific ligand described for DC-SIGN so far. Molecular modeling further revealed that the observed binding of this schistosome-specific pseudo Lewis Y motif to DC-SIGN is not directly compatible with the published model described for Lewis X. To fit pseudo-Lewis Y into the model, the orientation of the side chain of Phe313 in the secondary binding site of DC-SIGN was slightly changed, resulting in an energetically perfect stacking of Phe313 with the hydrophobic side of the galactose-linked fucose of pseudo-Lewis Y. We propose that pathogens such as S. mansoni may use this observed flexibility in the secondary binding site of DC-SIGN to target DCs, which may contribute to an escape from the host s immune response. Furthermore, we were able to detect the presence of both Lewis X and pseudo-Lewis Y carbohydrate epitopes in glycolipids derived from cercarial S. mansoni excretory/secretory products, underlining their role in the immunobiology of schistosome infection. L-SIGN, i.e., the second human C-type lectin investigated, functions as antigen receptor on human liver sinusoidal endothelial cells. As the eggs of S. mansoni are the main inducers of a Th2 response, we were interested, as to whether glycans expressed on egg glycoproteins or egg glycolipids may play a role in this immune response, e.g., via binding to L SIGN. Our data demonstrate that L-SIGN binds both schistosomal soluble egg antigens (SEA) and egg glycosphingolipids, and can mediate internalization of SEA by L-SIGN expressing cells. After treatment of SEA with endoglycosidase H to remove high-mannose type N glycans, binding to L-SIGN and internalization by L-SIGN expressing cells was clearly reduced, whereas defucosylation affected neither binding nor internalization. These data indicate that L-SIGN interacts with high-mannose type N glycans of SEA. In parallel, L-SIGN was also tested for binding to egg glycosphingolipids. To this end, isolated glycolipids were fractionated and tested in binding studies using L SIGN transfected cells. The results revealed that L-SIGN binds to a glycosphingolipid fraction containing fucosylated species with compositions of Hex1HexNAc5& #8722;7dHex3& #8722;6Cer, as confirmed by mass spectrometry. Subsequent linkage analyses, tandem mass spectrometry and molecular modeling studies demonstrated that binding of L-SIGN to the respective fucosylated egg glycosphingolipid species involves a Fucalpha1-3GalNAcbeta1-4(Fucalpha1-3)GlcNAc tetrasaccharide (F-LDN-F) at the non-reducing end of the carbohydrate chain. The L-SIGN gain of function mutant Ser363Val, which recognizes fucosylated Lewis antigens, did not bind to this fucosylated egg glycosphingolipid fraction, suggesting that L-SIGN exhibits different modes of binding to fucoses of egg glycosphingolipids and Lewis antigens. Taken together, our data indicate that L-SIGN recognizes both high mannose type N glycans and fucosylated carbohydrate motifs within schistosomal egg antigens, demonstrating that L-SIGN has a broad but specific glycan recognition profile. It is astonishing that such highly related C-type lectins differ in their carbohydrate recognition properties. Clearly, further studies are needed to gain deeper insights in the manifold ways parasitic glycans are able to bind to human C-type lectins and thereby influence the host s immune response.