Entwicklung neuer Methoden zur Ergebnisvalidierung in der massenspektrometrischen Proteomanalytik

Abstract

Die sichere Identifizierung von Proteinen aus komplexen Probenmischungen stellt ein Problem in der Proteomforschung dar. Ein kürzlich durchgeführter Ringversuch zur Proteinidentifizierung aus einer aliquotierten Zelllysatprobe ergab nur wenige Übereinstimmungen zwischen den Ergebnissen aus den verschiedenen massenspektrometrischen Methoden der sechs teilnehmenden Firmen.[1] Nur 3 % aller identifizierten Proteine konnten von allen Teilnehmern gemeinsam gefunden werden, während 97 % der insgesamt identifizierten Proteine von mindestens einem Teilnehmer nicht gefunden wurden. Dies weist darauf hin, dass validierte, sichere Verfahren in der Massenspektrometrie (MS) noch fehlen. Ein wesentliches Problem scheint in den wahrscheinlichkeitsbasierten Zuordnungen der in Datenbanken verzeichneten Sequenzen zu den MS-Daten zu liegen. Die Wahl der Methode zur Interpretation der Fragmentionen-(MS/MS-) Spektren für die Proteinidentifizierung aus hochkomplexen Peptidmischungen spielt dabei eine Schlüsselrolle hinsichtlich der Qualität dieser Ergebnisse. Es hat sich erwiesen, dass gerade wenn das Spaltenzym nicht bekannt ist, eine Datenbank-unterstützte Proteinidentifizierung meistens fehlschlägt oder fragwürdige, mehrdeutige Ergebnisse liefert. In dieser Arbeit wurde ausgehend von der klassischen, aufwändigen Analytik MHC-Klasse-I bindender Peptide eine neue Methode entwickelt, die zu validierten, vertrauenswürdigen Ergebnissen führt.[2] Sie besteht aus einer minimierten Probenaufarbeitung einer renalen Humankarzinomzelllinie mittels unspezifischer Säureelution und Ultrafiltration und basiert auf einer verifizierbaren Analyse von hochpräzise gemessenen MS- und MS/MS-Daten. Bei deren Auswertung wird neben der automatischen Datenbanksuche ein Datenbank-unabhängiges, auf Aminosäurezusammensetzungen basierendes de novo-Sequenzierungsverfahren [3] angewendet. Dieses Verfahren dient zur Datenverifizierung der im ersten Schritt erhaltenen Ergebnisse auch ohne Angabe eines spezifischen Spaltenzyms und stützt sich auf die Kenntnis der akkuraten Massen nicht nur der Vorläuferionen, sondern auch der Fragmentionen. Das neu entwickelte Validierungsverfahren nutzt somit ein iteratives Zusammenspiel von schneller Datenbanksuche und zuverlässiger de novo-Sequenzierung auf Grundlage der höchstgenau gemessenen Massen. Durch diese neu entwickelte Methode wurden autoproteolytisch entstandene Peptide mit unbekannter Entstehungsgeschichte sowie ihre zugehörigen Ursprungsproteine eindeutig identifiziert, so dass auch solche Peptide eine nützliche Quelle für die Charakterisierung biologischer Proben darstellen können. Außerdem konnten durch die analoge Anwendung des neuen Validierungsverfahrens auf die mithilfe der spezifischen Immunaffinitätschromatographie klassisch aufbereiteten Proben weitere MHC-Klasse-I bindende Peptide auch ohne zusätzliche Synthese der Referenzpeptide erfolgreich identifiziert werden. [1] Chamrad und Meyer, Nature Methods 2005, 2, 647 [2] Thieu et al., Angewandte Chemie International Edition 2006, 45, 3317 [3] Spengler, Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2004, 15, 703 Reliable identification of proteins from complex samples is a problem in proteomics research. A recent round-robin test of protein identification from a cell lysate showed only limited overlap between the results from the different mass spectrometric methods of the six participating companies.[1] Only three percent of all identified proteins were found by all participants, while 97 percent of the identified proteins were missing by at least one participant. This indicates that validated, reliable procedures in mass spectrometry (MS) are still missing. A possible reason for the prominent problem can be the probability-based allocations of database sequences to MS data. The choice of the method of interpretation of fragment ion (MS/MS) spectra in protein identification from highly complex peptide mixtures plays a key role in the procedure regarding the quality of these results. It was found that, especially if the cleavage enzyme is unknown, database assisted protein identification mostly fails or produces unreliable, equivocal results. In this work a new method [2] was developed on the basis of the conventional, time consuming analysis of MHC class I binding peptides, resulting in validated, reliable results. It consists of a minimized sample preparation of a human renal carcinoma cell line by nonspecific acid elution and ultrafiltration. It is based on a verifiable analysis of highly precise MS and MS/MS data. During evaluation a database independent, amino acid composition-based de novo sequencing method [3] is applied in addition to an automatic database search. This method serves as data verification of the results received in the first step of protein identification, even without the specification of a particular cleavage enzyme and is based on the knowledge of accurate masses not only of precursor ions, but also of fragment ions. Thus the newly developed validation method uses an iterative combination of fast database search and reliable de novo sequencing on the basis of accurately measured mass values. By this means autoproteolytically derived peptides with unknown origin as well as their associated proteins were unequivocally identified. They represent a useful source for the characterisation of biological samples even from such peptides. Further MHC class I binding peptides were identified from conventionally prepared samples obtained from immune affinity chromatography. Applying the new validation method unequivocal identifications were obtained also without additional synthesis of reference peptides. [1] Chamrad and Meyer, Nature Methods 2005, 2, 647 [2] Thieu et al., Angewandte Chemie International Edition 2006, 45, 3317 [3] Spengler, Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2004, 15, 703