Natur und Funktion der Hepatitis B Virus Proteinkinase

Abstract

Für das Hepatitis B Virus wurden neben der Proteinkinase C noch vier andere potentielle Proteinkinasen (GAPD, CAK, SRPK-1, SRPK-2) beschrieben, die das Capsidprotein phosphorylieren können. Der Zeitpunkt der Phosphorylierungen vor oder nach der Capsidbildung ist jedoch unbekannt. Um die Natur und Funktion der Proteinkinasen zu untersuchen, wurden Versuche mit Isotyp-spezifischen Proteinkinase C Inhibitoren in assemblierten Capsiden durchgeführt. Um eine allgemeine Übertragbarkeit der Ergebnisse zu untersuchen, wurden verschiedene Genotypen des HBV, sowohl aus Patientenplasmen als auch aus Zellkultur, für die Experimente verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass unabhängig vom HBV-Genotyp und dem Ursprung der Capside eine Proteinkinase C des Isotyp alpha oder beta verpackt worden war. Inhibitionen dieser PKC Isoformen in der stabil das HBV exprimierenden Zelllinie HepG2.2.15 belegten, dass die PKC-Phosphorylierung essentiell für die Verpackung der Capside in die Hüllproteine ist. Die Analyse der Proteinkinase in Virus-extrahierten Capsiden, die trotz PKC-Inhibition sekretiert worden waren belegte, dass auch diese PKC beinhalteten, also kein Ersetzen von PKC durch eine andere zelluläre Proteinkinase erfolgt. Korrespondierend zur herabgesetzten Virussekretion zeigte sich eine intrazelluläre Akkumulation von Capsiden, die allerdings auch durch eine erhöhte Stabilität der Capside bedingt gewesen sein könnte. Zusammengefasst zeigen die Befunde, dass das HBV Capsidprotein nach dem Capsidassembly spezifisch durch Proteinkinase C wahrscheinlich des Isotyps beta phosphoryliert wird und diese Phosphorylierung essentiel für den hepadnaviralen Lebenszyklus ist. Dessen ungeachtet erscheint es jedoch wahrscheinlich, dass der Capsidprotein-Phosphorylierung durch eine weitere Proteinkinase vor dem Assembly eine wesentliche Bedeutung zukommt, z.B. im Rahmen der Prägenom-Verpackung. Beside protein kinase C four other potential protein kinases (GAPD, CAK, SRPK-1, SRPK-2) were described for phosphorylation of the hepatitis B virus capsid protein. Whether phosphorylation takes place prior or after the capsid assembly is unknown. For characterization and function of the protein kinase within assembled capsids experiments with isotyp specific protein kinase C inhibitors were performed. Capsids from different HBV genotyps derived from patient plasma or from cell culture were used in order to allow general conclusion. It could be demonstrated that an isotyp alpha or beta protein kinase C was present inside of the capsids. This finding was independent upon genotyp or origin of the capsids. Inhibition of these two isoforms in the stably HBV expressing cell line HepG2.2.15 showed that phosphorylation with protein kinase C was essentiell for capsid envelopment into the surface proteins. Analysis of the protein kinase in capsids of viruses, which were secreted despite the presence of the PKC inhibitor, demonstrated that these capsids still contained PKC. Hence, protein kinase C could not be replaced by another cellular protein kinase. Coherently to lower virus secretion an intracellular capsid accumulation was observed although increased capsid stability could not be excluded. In summary these results show that the HBV capsid protein after assembly becomes phosphorylated from a protein kinase C likely of the isotyp beta. This phosphorylation is essential for the hepadnaviral life cycle. Despite of these findings a phosphorylation of the capsid protein before the assembly is likely. Presumably this modification is performed by another protein kinase and is essential e.g. in pregenome packaging.