Immunhistologische Identifikation von Proteinen des Cytoskeletts und Feinbau isolierter Seitenlinien-Haarsinneszellen von Pantodon buchholzi

Abstract

Die cephalen Seitenlinienneuromasten des Fisches Pantodon buchholzi enthalten ca. 20.000 Haarsinneszellen (HSZ). Diese hohe Zellzahlerlaubt es lebende HSZ aus dem Neuromastengewebe zu isolieren. Das Ziel der vorliegenden Studie war es das Cytoskelett dieser Zellenzu charakterisieren, da dieses, wie an HSZ höherer Vertebraten gezeigt werden konnte, an Signaltransduktionsprozessen beteiligt ist.Mithilfe von Immunfluoreszenzfärbungen und konfokaler Mikroskopie wurden dabei sechs verschiedene Proteine identifiziert und derenVorkommen und Lokalisation innerhalb der HSZ aufgeklärt. Zusätzlich konnte der morphologische Feinbau der isolierten Zellen unterVerwendung der Rasterelektronenmikroskopie untersucht und die Zelldimensionen bestimmt werden. Die mit spezifischen Antikörpern nachgewiesenen Cytoskelettproteine Aktin, alpha-Aktinin, Bande 3 (AE1), Myosin, Spektrin und alpha-Tubulinzeigten folgende Verteilung innerhalb der isolierten HSZ: Aktin war im Haarbündel der Sinneszelle sowie ringförmig im Bereich der Zonula adhaerens (ZA) stark konzentriert. Innerhalb derCuticularplatte konnte dagegen nur eine schwache Anfärbung gesehen werden. Im Lateralbereich des Zellkörpers war ein punktförmigesMarkierungsmuster zu erkennen, was auf kurze Aktinfilamente in dieser Region hinweist. alpha-Aktinin war ausschließlich im Bereich um die Cuticularplatte (ZA-Region) als Ringstruktur detektierbar. Bande 3 (AE1)-Fluoreszenz konnte im Bereich der Cuticularplatte und als Ring um selbige nachgewiesen werden. Auch lateral im Bereichder Zellmembran und im gesamten Cytoplasma der HSZ waren Strukturen markiert. In einigen Zellen zeigten die Stereocilien und dasKinocilium schwache Fluoreszenz. Myosin-Antikörper färbten die Cuticularplatte und deren Randbereiche (ZA-Region) sowie das Cytoplasma der HSZ. Auch der lateraleZellmembranbereich wies Fluoreszenz auf. Bei einigen Zellen konnte eine Markierung der Stereocilien, die im Spitzenbereich der größtenCilien verstärkt war, gesehen werden. Die Anfärbung des Aktin-bindenden Proteins Spektrin umfasste die Cuticularplatte, den infracuticulären Raum und den Lateralbereich derZelle. Zusätzlich war der Zellkern von Spektrinstrukturen umgeben. alpha-Tubulin konnte im Kinocilium und im Zellkörper als Mikrotubuli nachgewiesen werden. Hierbei fanden sich, netzwerkartig verlaufend,Mikrotubuli, die vom Cuticularplattenrand in die basalen Regionen der Zelle zogen. Dabei schienen die Tubulinfilamente auf denzellmembrannahen Bereich beschränkt zu sein und die Zelle mantelförmig zu umgeben. In der Cuticularplatte und den Stereocilien waralpha-Tubulin nicht nachweisbar. Die Lokalisation bzw. Kolokalisation insbesondere von Aktin und Myosin aber auch anderer oben genannter Aktin-bindender Proteinezeigen Ähnlichkeiten zur Verteilung der Proteine in HSZ höherer Vertebraten und äusseren HSZ von Säugetieren. In genannten Zellenwerden diese Cytoskelettstrukturen für Adaptations- und Signaltransduktions-Prozesse sowie Motilitätsvorgänge verantwortlich gemacht.Die Ergebnisse der Studie legen die Schlussfolgerung nahe, dass ähnliche Prozesse bei HSZ der Seitenlinie verwirklicht sind. The lateral line system of Pantodon buchholzi is characterized by well developed dorsal cephalic lateral line organs which contain up to20.000 hair cells. This high number of cells allows the isolation of viable hair cells. The objective of this study was to investigate thecytoskeletal organisation of isolated hair cells in order to infer from morphological characteristics on functions concerning the signaltransduction. To this end confocal microscopy was applied and the cellular ultrastructures were examined by scanning electron microscopy. Six different cytoskeletal proteins were analyzed using antibodies specific for actin, alpha-actinin, band 3 (AE 1), myosin, spectrin andalpha-tubulin: Actin showed a strong immunfluorescence in the area of the circumferential band (zonula adhaerens ZA associated) whereas labelling ofthe cuticular plate was weak. Additionally, actin fluorescence could be detected in a dotlike distribution in the region near the plasmamembrane indicating short actin filaments in this part of the cell. alpha-Actinin exclusively exhibited staining within the circumferential band (ZA region) creating a ring structure around the cuticular plate. Band 3 (AE 1) labelling was detected in the cuticular plate and within the region surrounding it (ZA region). In addition the lateral area of thecells (i.e. within the plasma membrane) as well as the cytoplasm revealed band 3 immunoreactivity. In some cells the stereocilia and thekinocilium showed a weak fluorescence pattern. Myosin antibodies stained the cuticular plate and the circumferential band (ZA associated). Furthermore fluorescence was detected withinthe cytoplasm in dotted structures and near the lateral plasma membrane. In some cells, stereocilia showed a dotlike fluorescence patternwith a more intense staining at the tips of the longest stereocilia. Spectrin as another actin-binding protein was localized within the cuticular plate and the infracuticular region. In addition the cortical cellarea showed immunoreactivity and the nucleus was surrounded by fluorescent structures. Cells stained with a-tubulin antibodies revealed label of the kinocilium and of microtubules which seemed to be distributed like ameshwork around the cell body. This was located exclusively beneath the plasma membrane. The cuticular plate as well as the stereociliawere free of alpha-tubulin structures. The localization respectively co-localization especially of actin and myosin but also other actin-binding proteins mentioned above showedsimilarities to hair cells of higher vertebrates and outer hair cells of mammals. In these cells the cytoskeletal structures seem to beresponsible for signal transduction and adaptation mechanisms as well as motile responses. The described data suggest that similarmechanisms are carried out by lateral line hair cells of Pantodon buchholzi.