Die Hemmung der Ras-abhängigen Signaltransduktion durch 3-Deazaadenosin verhindert die Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen sowie die Neointimabildung

Abstract

3-Deazaadenosin ist ein effektiver Hemmstoff der die Aktivität zellulärer Methyltransferasen regulierenden SAH-hydrolase. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass c3Ado über seine antiinflammatorischen Wirkungen die Bildung atherosklerotischer Läsionen verhindern kann. In der hier vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von c3Ado auf die Funktion glatter Gefäßmuskelzellen und die Bildung einer Neointima in vivo untersucht, da diesen Vorgängen eine Schlüsselrolle in der Entstehung und bei Komplikationen vaskuloproliferativer Erkrankungen zukommt. Die Proliferation und Migration glatter Gefäßmuskelzellen in vitro wurde durch die Applikation von c3Ado dosisabhängig reduziert. Dies war begleitet von einer gesteigerten Expression der Zyklin- Kinase- Inhibitoren p21waf/cip1 und p27Kip1, einer verminderten Expression der G1/S-Phase Zykline und einer verminderten Phosphorylierung des Retinoblastom-Genproduktes. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigte sich in der FACS-Analyse propidiumjodidgefärbter Zellen ein Zellzyklusarrest in der G0/ G1-Phase des Zellzyklus. Diese Effekte waren weder durch eine gesteigerte Apoptoserate noch durch eine erhöhte Toxizität dieser Substanz bedingt. Weitergehende Untersuchungen zeigten, dass die Applikation von c3Ado über die Hemmung der SAH-hydrolase zu einer verminderten Aktivität der ICMT führt. Dies hemmt den letzten Schritt der posttranslationalen Modifikationen der Ras-Proteine, die Carboxylmethylierung. Die Translokalisation von Ras an die Plasmamembran und dessen nachfolgende Aktivierung ist somit nicht mehr möglich. Folge ist eine Hemmung der Ras-abhängigen Signaltransduktionswege. Entsprechend dieser Ergebnisse zeigten weitere Western Blot Analysen eine dosisabhängige Abnahme der FCS-induzierten ERK und Akt-Phosphorylierung. Durch die Überexpression einer konstitutiv aktiven Ras-Mutante konnte der Effekt von c3Ado auf die Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen aufgehoben werden. Für die in vivo Versuche wurde die A. femoralis von C57BL/6 Mäusen dilatiert. Anschließend erhielten sie eine atherogene Diät ohne oder mit Zusatz von c3Ado. Die Fütterung mit 150 µg c3Ado verhinderte die durch Dilatation induzierte Ras-Aktivierung sowie die Phosphorylierung von Akt und ERK. Des Weiteren führte die orale Aufnahme von c3Ado über 21 Tage nach Dilatation zu einer signifikanten Reduktion der Anzahl proliferierender Zellen in Neointima und Media sowie der Fläche der Neointima im Vergleich zur Kontrollgruppe. Auch in vivo führte die Applikation von c3Ado nicht zu einer Steigerung der Apoptoserate. Die hier vorgelegten Ergebnisse zeigen, dass c3Ado in die Ras-Methylierung und Aktivierung eingreift und somit die mitogene Aktivierung von ERK und Akt hemmt. Dies resultiert in einer Hemmung des Zellzykluseintritts, einer verminderten Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen und somit auch in einer reduzierten Neointimabildung nach Angioplastie. Somit könnte die Hemmung der SAH-hydrolase durch c3Ado einen neuen Ansatz zur Verhinderung vaskuloproliferativer Erkrankungen darstellen. 3-Deazaadenosine (c3Ado) is a potent inhibitor of S-adenosylhomocysteine (SAH)-hydrolase which regulates cellular methyltransferase activity. In the present study we sought to determine c3Ado s effect on vascular smooth muscle cell (VSMC) function and neointima formation in vivo.C3Ado dose-dependently prevented the proliferation and migration of human coronary VSMC in vitro. This was accompanied by an increased expression of the cyclin-dependend kinase inhibitors p21WAF1/Cip1, p27Kip1, a decreased expression of G1/S-phase cyclins and a lack of retinoblastoma protein hyperphosphorylation. In accordance with these findings, FACS analysis of propidium iodide stained cells indicated a cell cycle arrest in the G0/G1 phase. Importantly, c3Ado did not affect the number of viable (trypan blue exclusion) or apoptotic cells (TUNEL). Mechanistically, c3Ado prevented FCS-induced Ras carboxyl methylation, membrane translocation and activity by inhibiting isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase, and reduced FCS-induced ERK 1/2 and Akt phosphorylation in a dosedependent manner. Conversely, rescuing signal transduction by overexpression of a constitutive active Ras mutant abrogated c3Ado s effect on proliferation. For in vivo studies, the femoral artery of C57BL/6 mice was dilated and mice were fed with a diet containing 150 µg c3Ado/day. c3Ado prevented dilation-induced Ras-activation as well as ERK 1/2 and Akt phosphorylation in vivo. At day 21, VSMC proliferation (7.9 ±0.7 % vs. 10.8 ± 0.8 % PCNA pos. cells, P < 0.05) as well as the neointima/media ratio (0.7 ± 0.2 vs. 1.6 ± 0.4; P < 0.05) were significantly reduced, without any changes in the number of apoptotic cells. Our data indicate that c3Ado interferes with Ras methylation and function and thereby with mitogenic activation of ERK 1/2 and Akt, preventing VSMC cell cycle entry and proliferation and neointima formation in vivo. Thus, therapeutic inhibition of SAH-hydrolase by c3Ado may represent a novel approach to prevent vascular proliferative disease.