Regulation des epithelialen Natriumkanals (ENaC) durch cAMP, Vasotocin und Glibenclamid

Abstract

Der epitheliale Na+-Kanal (ENaC) besteht aus homologen Untereinheiten, die mit alpha, beta und gamma bezeichnet werden. Die aus demMeerschweinchencolon klonierte alpha-Untereinheit (gpalpha) wurde mit der beta- und gamma-Untereinheit des Xenopus-ENaC (chibetagamma-ENaC) in Xenopuslaevis Oocyten coexprimiert. Dieser Hybridkanal (gpalphachibetagamma-ENaC) wurde mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp -Methodeuntersucht. Dosis-Wirkungs-Kurven mit dem spezifischen Blocker Amilorid lieferten für den vorliegenden gpalphachibetagamma-ENaC einen ki-Wert, der in sehrguter Übereinstimmung mit den Daten steht, die von anderen klonierten ENaCs berichtet werden. Somit zeigt der gpalphachibetagamma-ENaC ein fürhochaffine ENaCs typisches pharmakologisches Profil. Während der Ratten-ENaC (rENaC) - generierte Na+-Strom in Oocyten gar nicht durch cAMP aktivierbar ist, und sich der xENaC -vermittelte Na+-Strom durch cAMP-Applikation nur um 79 % erhöhte, zeigten gpalphachibetagamma-ENaC exprimierende Oocyten nach Perfusion mitcAMP eine Zunahme des Amilorid-sensitiven Natriumstroms (Iami) um durchschnittlich 530 %. Folglich muss die gpa-Untereinheit für diehohe cAMP-Sensitivität verantwortlich sein. Der schnelle Anstieg des Na+-Stroms und das Ausmaß der Stimulation lassen vermuten, dasssowohl bereits in der Zellmembran vorhandene ENaCs aktiviert als auch neue Kanäle eingebaut wurden. Experimente mitArginin-Vasotocin belegen, dass dieses Peptidhormon hier als first messenger fungieren kann und somit die beobachtetecAMP-Aktivierung des Na+-Stroms erklärt. Neben cAMP konnte auch Glibenclamid spezifisch den Iami gpalphachibetagamma-ENaC exprimierender Oocyten signifikant steigern. Diese Aktivierungum durchschnittlich 117 % war unabhängig von cAMP. Da es sich um additive Effekte der beiden Substanzen handelte, liegen offenbarverschiedene Signaltransduktionswege vor. Untersuchungen an Oocyten, die eine a-Chimäre aus Ratten - und Meerschweinchen-ENaCmit xhibetagamma-ENaC exprimierten, zeigten dann eine verminderte Glibenclamid-Sensitivität, wenn die extrazelluläre Schleife des alpha-ENaC von derRatte stammte. Dies lässt darauf schließen, dass der extrazelluläre Anteil des Kanals Angriffsort der Glibenclamidwirkung ist. Neben demENaC als direktem Ziel für Glibenclamid lässt sich eine Inhibierung des eventuell in Xenopus Oocyten vorkommendenSulfonylharnstoffrezeptors nicht ausschließen. Die vorliegenden Ergebnisse beweisen, dass der gpalphachibetagamma-ENaC - vermittelte Na+-Strom in Xenopus Oocyten signifikant durch cAMP undGlibenclamid erhöht wird. Künftige Forschungen werden zeigen, auf welchem Regulationsweg cAMP und Glibenclamid diesen Effektbewirken. The epithelial sodium channel (ENaC) is a heterotetrameric protein which consists of homologous 2a -, 1b - and 1g - subunits. The cRNAencoding the alpha-subunit of guinea-pig colon ENaC (gpalpha-ENaC) was coinjected with cRNA encoding the b - and g -subunits of XenopusENaC (chibetagamma -ENaC) into Xenopus laevis oocytes. This hybrid channel was investigated by employing two microelectrode-voltage-clamptechnique. In order to determine whether gpalphachibetagamma-ENaC possesses a pharmacological profile known from other ENaCs, oocytes expressing thishybrid channel were perfused with increasing concentrations of amiloride. A Michaelis-Menten-fit gave a half-maximal blockerconcentration of 130 nM. This ki-value stands in good accordance with the ki-values reported for other ENaCs. Whereas the cloned ENaC from rat colon (rENaC), expressed in Xenopus oocytes is not sensitive to cAMP, the amiloride-sensitiveNa+-current (Iami) of gpalphachibetagamma -ENaC expressing oocytes was stimulated by membrane permeant cAMP about 530 %. Since Iami of xENaCexpressing oocytes only increased about 79 % due to the application of cAMP, the cAMP-sensitivity must be conferred on the other clonedENaCs by the gpalpha-subunit. The rapid increase of the sodium current and the extent of the stimulation indicates that cAMP, as secondmessenger, caused an activation of ENaCs previously silent in the membrane, as well as an additional insertion of new channels into themembrane. Experiments conducted with arginine-vasotocin (AVT) showed that this peptide-hormone can work as a primary messenger forthe cAMP-mediated increase of the Na+-current. The treatment of oocytes expressing gpalphachibetagamma-ENaC with glibenclamide elevated Iami about 117 %. In contrast, the amiloride-sensitiveNa+-current of ralphachibetagamma -ENaC expressing oocytes, only increased about 17 % due to the perfusion with glibenclamide. These datademonstrate that replacement of the gpa -subunit with the ra -subunit is sufficient to eliminate the stimulatory effect of glibenclamide. Sincethe perfusion of oocytes expressing gpalphachibetagamma-ENaC with cAMP, following a prestimulation by glibenclamide, additionally increased Iami, theeffect of glibenclamide seems to be independent of the cAMP-mediated pathway. In order to characterize the glibenclamide-sensitivecomponent of gpalpha-ENaC, chimeras were constructed by swapping N- or C-terminal intracellular domains between gpa - and ra - subunits.These mutants were coexpressed with xbg-ENaC. All chimeras which possessed the extracellular loop of ra-ENaC exhibited a significantlysmaller activation from glibenclamide. This indicates that the extracellular component of the gpa -subunit is responsible for sensitivity toglibenclamide. Besides the channel protein as the direct target for glibenclamide, an inhibition of a possible sulfonylureareceptor in oocytescannot be excluded. The data clearly demonstrate that gpalphachibetagamma-ENaC generated Na+-current is significantly activated by cAMP and glibenclamide.