Noroviren und Sapoviren bei landwirtschaftlichen Nutztieren

Abstract

Noroviren und Sapoviren repräsentieren unterschiedliche Genera innerhalb der Virusfamilie Caliciviridae. Caliciviren sind unbehüllte RNS-Viren mit einer Größe von 27-40 nm und einem einzelsträngigen Genom positiver Polarität mit einer Länge von 7,4-7,7 Kb. Noro- und Sapoviren sind wichtige Verursacher humaner Gastroenteritiden und kommen auch bei landwirtschaftlichen Nutztieren vor, im Einzelnen bovine Noroviren, porzine Noroviren und porzine enterale Sapoviren. Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren die Ermittlung der Prävalenz und Bedeutung von Noro- und Sapovirusinfektionen bei landwirtschaftlichen Nutztieren durch Virusdetektion sowie die Bestimmung der Verwandtschaft zwischen animalen und humanen Isolaten. Der letztgenannte Aspekt sollte zusätzlich Hinweise liefern, inwieweit die Gefahr einer zoonotischen Übertragung von Mensch zu Tier und umgekehrt besteht. Es wurden Kotproben von landwirtschaftlichen Nutzieren (Rindern, Schweinen, kleinen Wiederkäuern) gesammelt. Zusätzlich wurden im Rahmen der Routinediagnostik des Instituts für Virologie eingesandte Kot- und Organproben untersucht. Ein Fragebogen zu Daten der Einzeltiere sowie zur Bestandssituation begleitete die Probensammlung und wurde ebenso wie Angaben auf den Untersuchungsvordrucken der eingesandten Proben statistisch im Hinblick auf Zusammenhänge einer Noro- oder Sapovirusinfektion mit spezifischen Parametern analysiert. Mit Hilfe der Reversen Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) konnte Norovirus-RNS in 32 von 546 Kotproben von Rindern detektiert werden (5,9%). Darüber hinaus wurden in acht von 132 Kotproben von Schweinen Sapovirus-RNS nachgewiesen (6,1%). In der Mehrzahl der Fälle war das Vorkommen virusspezifischer RNS mit dem Vorliegen einer Diarrhöe verbunden. Statistisch signifikant war das Vorkommen von Noro- und Sapovirusinfektionen bei Jungtieren. Weitere signifikante Parameter waren bei den Norovirus-positiven Rindern (gesammelte Proben) die Jahreszeit der Probensammlung (Herbst und Winter), die Betriebsform (Zucht-, Milchviehhaltung) sowie das Bestandsproblem Atemwegserkrankungen und das Auftreten von Todesfällen im Bestand. Bei den Sapovirus-positiven Proben von Schweinen waren pathologische Veränderungen von Haut und Hautanhangsorganen signifikant. Die Untersuchung von 32 Kotproben von kleinen Wiederkäuern sowie 20 Tieren anderer Spezies auf Noro- und Sapoviren verliefen negativ, ebenso die Untersuchung von 202 Proben von Rindern auf Sapoviren und 132 Proben von Schweinen auf Noroviren. Die RT-PCR-Produkte wurden kloniert, sequenziert und phylogenetisch analysiert. Die neu detektierten Virusisolate sind enger mit den bekannten animalen Noro- und Sapoviren verwandt als mit den humanen Viren. In zwei Proben von Schweinen lag eine Doppelinfektion mit zwei Sapoviren aus unterschiedlichen Genogruppen vor. Je eines der Virusisolate in beiden Proben könnte eine Rekombinante aus Vertretern unterschiedlicher Genogruppen porziner enteraler Sapoviren darstellen. Der Ausdruck Isolat steht im Rahmen dieser Arbeit für Viren von denen Nukleinsäureteilsequenzen bestimmt wurden, nicht für tatsächlich angezüchtetes Virus. Die Ergebnisse zeigen, dass Infektionen mit Noro- und Sapoviren sporadisch bei landwirtschaftlichen Nutztieren auftreten. Die Sequenzdaten geben keine Hinweise darauf, dass diese Viren direkt vom Menschen auf landwirtschaftliche Nutztiere oder umgekehrt übertragen werden. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden virusähnliche Partikel (VLPs) von bovinen Noroviren und porzinen enteralen Sapoviren mit Hilfe des Baculovirusexpressionssystems hergestellt. VLPs sind morphologisch und antigenetisch den nativen Virionen sehr ähnlich. VLPs für bovine Noroviren und porzine enterale Sapoviren stehen nun zur Etablierung von ELISA-Systemen zur Ermittlung der Antikörperprävalenz im Hinblick auf Noro- und Sapoviren bei landwirtschaftlichen Nutztieren zur Verfügung. Noroviruses and sapoviruses represent distinct genera within the virus family Caliciviridae. Caliciviruses are non-enveloped RNA viruses with a size of 27-40 nm and a single-stranded genome of 7.4-7.7 kb with positive polarity. Noro- and sapoviruses are important causative agents of human gastroenteritis and also occur in farm animals in particular bovine noroviruses, porcine noroviruses and porcine enteric sapoviruses. The aims of this study were to determine the prevalence and relevance of noro- and sapovirus infections in farm animals by virus detection as well as to investigate the relationship between animal and human isolates. The latter aspect addresses the possibility of virus transmission from animal to man and vice versa. Stool samples were taken from farm animals (cattle, swine, small ruminants). In addition samples sent in for routine laboratory diagnosis at the institute of virology were also examined. A questionnaire concerning individual data as well as the situation on the farm accompanied the sampling. The questionnaire and the data on the sample submission forms of the routine samples were statistically analysed with regard to correlations between the presence of noro- and sapovirus infection and specific parameters. Using RT-PCR norovirus RNA was detected in 32 of 546 samples from calves (5.9%). In addition, eight of 132 samples from swine were positive in an RT-PCR for sapovirus (6.1%). In most cases virus detection coincided with occurrence of diarrhea. Young animals had a statistically higher risk of noro- or sapovirus infection. Other significant parameters were the season of sampling (fall, winter) in the norovirus-positive cattle (questionnaire group) as well as the farm structure (breeding, dairy cattle), respiratory disease problems and the occurrence of deaths on farms. In the sapovirus-positive swine pathological disorders of the skin and skin organs turned out to be significant. In tests for noro- and sapoviruses 32 stool samples from small ruminants as well as 20 samples from animals of other species gave negative results. In addition 202 samples from cattle for sapoviruses and 132 samples from swine for noroviruses were found to be negative. The RT-PCR products were cloned, sequenced and phylogenetically analysed. The newly detected virus isolates are more closely related to known animal noro- and sapoviruses than to human isolates. In two samples from swine a double infection with members of two different genogroups of porcine enteric sapoviruses could be detected. One of the virus isolates in each sample may represent a recombinant between different sapoviruses. The term isolate stands for viruses from which partial nucleid acid sequences have been determined in this work, not for virus grown in culture. The results demonstrate that noro- and sapoviruses occur sporadically in farm animals. The sequence data give no indication that these viruses are transmitted directly from farm animals to humans or vice versa. The second part of the thesis addressed the production of virus-like particles (VLPs) of bovine noroviruses and porcine enteric sapoviruses using the baculovirus expression system. VLPs are morphologically and antigenetically similar to the native virions and can be used as antigens in different test systems. VLPs of bovine noroviruses and porcine enteric sapoviruses are now available to establish ELISA systems for determination of the antibody prevalence with respect to noro- and sapoviruses in farm animals.