Einflüsse auf die Sputum-Deoxyribonucleinsäure bei Mukoviszidose (Zystische Fibrose)

Abstract

Hintergrund Sputum von Mukoviszidose(cystic fibrosis, CF)-Patienten enthält ca. 3 15 g DNA/ml Sputum, die erheblich zur Viskositätserhöhung des Sputums beiträgt und somit eine Expektoration desselben erschwert. Überwiegend stammt die DNA aus zerfallenden polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN). Seit Anfang der 90er Jahre wird rekombinante humane (rh)DNase I (Pulmozyme) bei CF-Patienten inhalativ verabreicht. Ziel ist dabei, die längerkettigen DNA-Fragmente zu spalten, somit die Viskosität des Sputums herabzusetzen und die Expektoration zu erleichtern. Die Erfolge dabei variieren jedoch von Patient zu Patient erheblich, so dass sich auch wegen der hohen Kosten des Medikamentes die Frage stellt, welche Kriterien für die Einleitung einer Inhalationstherapie mit DNase definiert werden sollten. Es liegen außerdem Untersuchungen vor, denen zufolge die Inhalation von DNase I zu einer Erhöhung der Elastaseaktivität im Sputum führen soll. Dies wäre bedenklich, da humane Neutrophilenelastase (HNE) maßgeblich an der Destruktion des Lungengewebes beteiligt ist. Eine weitere Überlegung ist, dass die Wirkung von rhDNase möglicherweise durch eine gleichzeitige inhalative Gabe von pulmonalem Surfactant verbessert werden könnte. Bevor entsprechende Untersuchungen in vivo erfolgen, war jedoch zu klären, ob beide Medikamente sich nicht eventuell gegenseitig inhibieren. Methoden Ziel war es, die PMN im Sputum durch eine nichtenzymatische Aufbereitung zu isolieren und zu quantifizieren. Bei 51 Sputumproben von Mukoviszidosepatienten wurden Messungen der DNA-Konzentration und der HNE-Aktivität durchgeführt. Dabei wurde die DNA-Konzentration nach enzymatischer Spaltung mit RNase A photometrisch bei 260 nm ermittelt. Die HNE-Aktivität wurde unter Verwendung von Suc-L-alanyl-L-valyl-4nitroanilid als spezifischem chromogenem Substrat gemessen. Zur Überprüfung der DNase-Aktivität in Abhängigkeit von unterschiedlichen Surfactantkonzentrationen wurden 5 Agarose-Gel-Elektrophoresen und an 6 Sputumproben von CF-Patienten Kompressibilitätsmessungen durchgeführt. Um zu beurteilen, ob die oberflächenaktive Wirkung von Surfactant durch rhDNase beeinflusst wird, wurden Adsorptions- und dynamische Messungen der Surfactantaktivität in Anwesenheit unterschiedlicher DNase-Konzentrationen an einem Pulsating Bubble Surfactometer durchgeführt. Ergebnisse Mit dem methodischen Ansatz einer nichtenzymatischen Aufbereitung war es nicht in jedem Falle möglich, das Sputum von Mukoviszidosepatienten homogen zu suspendieren. Auf der Grundlage dieser Methode war deshalb eine zuverlässige Quantifizierung der PMN nicht zu erreichen. Die Untersuchungen ließen keinen eindeutigen Zusammenhang zwischen DNase-Therapie und Höhe der Elastaseaktivität erkennen, insbesondere ergab sich auch kein Hinweis, dass eine DNase-Therapie zu einer (potentiell nachteiligen) Erhöhung der Elastaseaktivität führen würde. Die Kompressibilitätsmessungen und die Messungen am Pulsating Bubble Surfactometer ergaben keine statistisch signifikanten Hinweise auf eine Inhibition der DNase-Wirkung bei Zugabe von Surfactant und umgekehrt. Eine gegenseitige Inhibition der Wirkung von DNase und Surfactant konnte durch unsere Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit für Pulmozyme und das in Deutschland sehr verbreitete Surfactantpräparat Alveofact ausgeschlossen werden. Schlussfolgerung Eine nichtenzymatische Aufbereitung des Sputum von Mukoviszidosepatienten ermöglicht keine zuverlässige Quantifizierung der PMN, was wiederum bedeutet, dass auf diese Weise kein Kriterium für den Beginn einer Therapie mit Pulmozyme etabliert werden konnte. Die Ergebnisse unterstützen die These, dass die Inhalation von rekombinanter humaner DNase I nicht zu einer Erhöhung der HNE führt. Eine Pulmozyme-Therapie erscheint daher diesbezüglich unbedenklich. Eine gemeinsame inhalative Verabreichung von Pulmozyme und Alveofact ist problemlos möglich, da sich kein Hinweis für eine gegenseitige Inhibition der beiden Medikamente fand. Weiterführende klinische Studien zur Überprüfung einer eventuell verbesserten Wirkung von Pulmozyme bei Kombination mit Alveofact sind daher sinnvoll und wünschenswert. Background The sputum of patients suffering from cystic fibrosis (CF) contains high concentrations of DNA (about 3 15 mg DNA/ml Sputum). It contributes considerably to the high viscosity of the CF sputum, thus, rendering expectoration more difficult. Most of the DNA is released by decaying polymorphonuclear neutrophile granulocytes (PMN). Recombinant human (rh) DNase I (German trade name Pulmozyme) has been administered to CF patients via inhalation since the beginning of the 90s. The idea is that long chain DNA fragments may be cleaved, thereby reducing sputum viscosity and facilitating expectoration. However, the therapeutic effects show marked interindividual variations. Furthermore, the high costs of the therapy have to be considered. Thus, the question arises for the criteria according to which an inhalative DNase therapy is defined as adequate. Several studies have indicated that inhalation of rhDNase I might result in elevated elastase activity in the CF sputum. This would point to a potentially harmful side effect of this therapy consisting in the enhanced release of human neutrophile elastase (HNE) which is known to contribute considerably to the destruction of pulmonary tissue in CF patients. The therapeutic effects of rhDNase might be improved by inhalative co-administration of pulmonary surfactant. However, before starting to study the combined effects in vivo it should be clarified by in vitro studies, whether rhDNase and surfactant inhibit each other. Methods The aim was to isolate PMN in sputum by a non-enzymatic assay in order to quantify the presence of PMN. In 51 sputum samples from CF patients DNA concentration and HNE activity were assessed. After enzymatic cleavage with RNase A, DNA concentration was measured photometrically at 260 nm. HNE activity was measured using Suc-L-alanyl-L-valyl-4nitroanilide as specific chromogenic substance. In order to measure DNase activity in presence of different surfactant concentrations, agarose gel electrophoresis was performed in sputum samples from 5 CF patients and a compaction assay was done in 6 CF sputum samples. Adsorption and dynamic measurements of surfactant activity in presence of different DNase concentrations were performed using a Pulsating Bubble Surfactometer in order to investigate whether surface active properties of surfactant are influenced by DNase. Results Using the non-enzymatic assay, it was not possible to obtain homogeneous suspensions of CF sputum for each sample. Thus, based on this method the PMN fraction could not be quantified reliably in the investigated group of patients. Our investigations showed no clear relationship between DNase application and elastase activity levels in CF sputum. In particular, no evidence was obtained that DNase therapy might induce a (potentially harmful) elevation of elastase activity. Mutually inhibitory effects of DNase and surfactant applications could be excluded under the treatment with Pulmozyme and surfactant preparation Alveofact commonly used in Germany. Conclusions Non-enzymatic processing of CF sputum with the assay used in the present study does not allow to quantify PMN reliably. Thus, this approach does not provide a reliable criterion for the decision whether or not to start a Pulmozyme therapy. The results support the hypothesis that inhalation of rhDNase I does not cause an elevation of HNE. Pulmozyme therapy therefore appears to be safe in this respect. There are no objections against the inhalative co-administration of rhDNase I and surfactant, since no indication for mutually inhibitory interactions between these two pharmaceuticals was found. Further clinical studies are necessary in order to investigate whether the effects of Pulmozyme are improved by combination with Alveofact.