In-vitro-Untersuchungen zur Adhäsivität, Invasivität und intrazellulären Persistenz von Salmonella-enterica-Impfstämmen

Abstract

Die aktive Immunisierung hat bei der Bekämpfung von Salmonellen in Nutztierbeständen international zunehmende Bedeutung. ModerneImpfstrategien gegen Salmonellen basieren fast ausnahmslos auf der Anwendung von Lebendimpfstoffen aus vermehrungsfähigenBakterien von bestimmten, stabil attenuierten Salmonella-Stämmen. Während die Wirksamkeit und Unschädlichkeit derSalmonella-Impfstämme meist recht gut dokumentiert sind, gibt es über die der Attenuierung zugrunde liegenden Mechanismen bislangnur Spekulationen. Um Ursachen für ihre Attenuierung aufzuklären, wurden drei attenuierte Salmonella enterica-Stämme, die die Grundlage vonkommerziellen Salmonella-Lebendimpfstoffen bilden (S.Typhimurium 'ZOOSALORAL H', S.Dublin 'BOVISALORAL' und S.Gallinarum9R 'NOBILIS'), im Zellkulturmodell auf ihre Adhäsivität, Invasivität und intrazelluläre Überlebensfähigkeit untersucht. Zum Vergleich wurdendie virulenten Wildtypstämme S.Typhimurium 'MOSKAU' (Mutterstamm von 'ZOOSALORAL H'), S.Dublin 442/012 (Mutterstamm von'BOVISALORAL') und S.Gallinarum 1910/93 herangezogen. Als Zielzellen wurden Zellen von Mensch (HEp-2), Huhn (HEF) und Rind (FKL)eingesetzt. Die bakteriellen Anheftungsmuster wurden mikroskopisch untersucht und zur Quantifizierung von Adhäsivität, Invasivität undintrazellulärer Überlebensfähigkeit der Salmonellen wurden Invasionstests (Inkubationsdauer 3 h bis 7 Tage) durchgeführt, in denen dieAnzahl der zellassoziierten und intrazellulären Bakterien bestimmt wurde. Alle untersuchten Impf- und Wildtyp-Stämme hefteten sich mit einem diffusen Adhäsionsmuster an alle verwendeten Zielzellarten, drangenin die Zellen ein und blieben intrazellulär für mindestens 2 Tage vermehrungsfähig. Der Impfstamm S.Tm 'ZOOSALORAL H' war gegenüber seinem Mutterstamm in allen drei Zellarten deutlich vermindert überlebensfähig. Der Impfstamm S.Dublin 'BOVISALORAL' zeigte sich gegenüber seinem Mutterstamm auf HEF- und FKL-Zellen vermindert adhäsiv.Zudem war seine Invasivität in die Rinderzelle (FKL) reduziert. Aus der verminderten Adhäsivität und Invasivität ergab sich, daß die Anzahlder intrazellulären Keime des Impfstammes 24 h nach der Inokulation nur ca. 30 % (FKL) bzw. ca. 20 % (HEF) der Keimzahl deskorrespondierenden Wildtypstammes entsprach. Der S.Gallinarum-Impfstamm 9R 'NOBILIS' adhärierte unabhängig von der Zielzellart zahlenmäßig sehr viel stärker als der zum Vergleichherangezogene S.Gallinarum-Wildtypstamm. Die erhöhte Adhäsivität machte sich auch in höheren Zahlen intrazellulärer Keimebemerkbar.Ein statistisch faßbarer Zusammenhang zwischen dem Verhalten der untersuchten Salmonella-Stämme in der Zellkultur undder tierartlichen Herkunft der verwendeten Zielzellarten bzw. den bekanntermaßen unterschiedlichen Wirtsspektren der untersuchtenSerovare war nicht nachweisbar. Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß die Attenuierung des Impfstammes S.Tm 'ZOOSALORAL H' zumindest teilweise die Folgeeiner Beeinträchtigung von Eigenschaften ist, die für das Überleben der Salmonellen in den Phagosomen von nicht-professionellphagozytischen Zellen des Wirtes erforderlich sind. Dagegen deuten die Meßergebnisse für den Impfstamm S.Dublin 'BOVISALORAL'darauf hin, daß der Virulenzverlust hier primär auf einem Defekt im Anheftungsprozeß beruht. Für den attenuierenden Mechanismus beidem Impfstamm S.Gallinarum 9R 'NOBILIS' ergaben sich in dem verwendeten Zellkulturmodell keine Anhaltspunkte. Ferner läßt sich ausden Ergebnissen ableiten, daß die Adaptation von S.Dublin an die Tierart Rind und von S.Gallinarum an Hühnervögel weder durchtierartlich spezifische Vorgänge bei der Adhäsion und Invasion noch durch spezifische Abläufe während der intrazellulären Lebensphase inepithelialen Wirtszellen bedingt ist. Vaccination against Salmonellosis is mostly based on Salmonella live vaccine strains. In most cases it is well documentated, that thevaccines are effective and harmless, but the underlying mechanisms of attenuation resist often speculative. In order to investigate thecauses of attenuation, three Salmonella live vaccine strains for use in animals (S.Typhimurium 'ZOOSALORAL H', S.Dublin'BOVISALORAL' and S.Gallinarum 9R 'NOBILIS') were examined for their adhesive, invasive and intracellular capabilities in a cell culturemodell. Virulent wild type strains S.Typhimurium 'MOSKAU' (parent strain of 'ZOOSALORAL H'), S.Dublin 442/012 (parent strain of'BOVISALORAL') and S.Gallinarum 1910/93 were used for pairwise comparison. Host cells were chick embryonal fibroblasts (HEF), fetalcalf lung cells (FKL), and cells from a human laryngeal carcinoma cell line (HEp-2). Bacterial adhesion patterns were assessed by lightmicroscopy. An invasion assay (coincubation of bacteria and host cells for 3 h to 7 days) was used for the quantification of adhesion,invasion and intracellular survival. All vaccine and wild type strains adhered to host cell monolayers with a diffuse adherence pattern, invaded into host cells, and could berecovered from the intracellular environment for at least 2 days after inoculation. However, beside this very similar behaviour on thequalitative level there were significant quantitative differences depending on the strain, the host cell and the parameter tested: The vaccine strain 'ZOOSALORAL H' was less able to survive in host cells than its parent strain. The number of intracellular bacteria of'ZOOSALORAL H' declined to 3 - 18 % within the first 24 h post inoculation. During the same period the numbers of intracellular wild typebacteria increased to 218 - 612 %. The vaccine strain 'BOVISALORAL' significantly less effectively adhered to HEF and FKL cells and less effectively invaded into FKL cellsthan its parent strain. After 24 h of coincubation numbers of intracellular bacteria of 'BOVISALORAL' reached only 30 % (FKL) or 20 %(HEF) of those yielded by S.Dublin 442/012. The S.Gallinarum vaccine strain 9R 'NOBILIS' adhered significantly less effectively to all host cells than the wild type strain of S.Gallinarumthat was used for comparison. No significant correlation was detected between the recognized host species adaption of a Salmonellaserotype and the behaviour of the Salmonella vaccine and wild type strains in the various cell culture systems. The results suggest, that the attenuation of these Salmonella vaccine strains is rather caused by downregulation of adhesion, invasion, andintracellular survival capabilities than due to a complete loss of these properties. Thus, the reduced virulence of 'ZOOSALORAL H' may bedetermined by a reduced intracellular survival in the phagosomes of non-professional host phagocytes. Similarily, an adhesion defect maycontribute to the avirulent phenotype of S.Dublin strain 'BOVISALORAL'. Results also suggest that the attenuated phenotype ofS.Gallinarum strain 9R 'NOBILIS' may not be determined by impaired adhesion, invasion or intracellular survival. Furthermore, the hostspecies adaption of certain Salmonella serovars seems not to be caused by a host species specific interaction between the bacterial cellsand the non-professional phagoycytes.