Interaktion der Na+,K+-ATPase mit Palytoxin und herzaktiven Steroiden an drei verschiedenen Isoformen der alpha-Untereinheit sowie die Identifikation von Aminosäuren aus dem Ionophor der Na+,K+-ATPase, die kritisch für den Ionentransport und die Enzymfunktion sind

Abstract

Herzglykoside binden spezifisch und reversibel an die a-Untereinheit der Natriumpumpe (Lingrel and Kuntzweiler 1994) und hemmen sie. An drei verschiedenen a-Untereinheiten wurde die Interaktion mit verschiedenen Herzglykosiden und deren Aglykonen untersucht. Am sensitivsten gegenüber Ptx ist die Kombination aus a1b1 (9,5 ± 0,12 nM). Für a2b1 (41,96 ± 0,11 nM) und a3b1 (23,51 ± 0,12 nM ) liegt die Konzentration für den halbmaximalen Kaliumefflux etwa viermal bzw. zweimal so hoch verglichen mit a1b1. Ouabain in µM-Konzentration drängt den Kaliumefflux bei allen drei Isoformen deutlich zurück (90,5%, 95,0% und 96,3% für a1, a2 und a3). Sowohl Oubagenin als auch Digitoxigenin zeigen eine ausgeprägte isoformspezifische Affinität, nicht jedoch das Bufalin. Die Unterschiede zwischen Herzglykosiden mit einem 5er- oder 6er- Lactonring sind nur geringfügig und können z.T. auch durch unterschiedlich gute Wasserlöslichkeiten hervorgerufen sein. Diese Arbeit unterstützt die These, dass die Zuckereinheit der Herzglykoside eine wesentliche Rolle für ihre Hemmung gegenüber Palytoxin spielt. Ouabagenin hebt sich von allen anderen untersuchten Inhibitoren ab, da es bei allen drei Isoformen eine geringe Hemmwirkung zeigt, sehr ausgeprägt vor allem bei a2. Die Untereinheit a2 ist auch diejenige Isoform, die gegenüber den anderen Glykosiden, die in dieser Arbeit verwendet wurden, ein anderes Verhalten zeigt. Einen gewissen Einfluss mag das geringere Expressionsniveau dieser Mutante haben. Die Na+, K+-ATPase (EC 3.6.3.9) gehört zur Familie der P-Typ-ATPasen. Es handelt sich um ein zelluläres Enzym, welches den Ionentransport durch die Zellmembranen bewerkstelligt. In der vorliegenden Arbeit wurden gezielt Aminosäuren der Na+, K+-ATPase homolog bzw. nicht-homolog ausgetauscht, um ihre Rolle bei der Koordination von Natrium- bzw. Kaliumionen zu untersuchen. Der Glutamatrest an Position 779 wurde durch den Austausch gegen Aspartat formell um eine Methylgruppe verkürzt und das hochkonservierte Asparagin 776 wurde in ein Isoleucin mutiert. Da die zum Asp804 korrespondierende Position in der Calcium-ATPase einen Asparaginrest trägt, wurde hier der Austausch Asparat gegen Asparagin vorgenommen. Das hochkonservierte Aspartat 807 wurde sowohl hinsichtlich der Ladung durch Einbau eines Glutamatrestes respektive Alaninrestes verändert. Das mutierte Protein wurde dann heterolog in der Hefe Saccharomyces cerevisiae exprimiert. Bei Hefen, die die Natriumpumpe mit der Mutation Glu779Asp exprimieren, ist der EC50-Wert etwa neunmal niedriger (0,81 ± 0,08 nM) im Vergleich zum Wildtyp (7,34 ± 1,67 nM). Für die weiteren Mutanten beträgt er 0,43 ± 0,10 nM (Asn776Ile), 3,62 ± 2,82 nM (Asp807Ala) bei 0,28 ± 0,05 nM (Asp807Gln). Die Dissoziationskonstante K0,5 für Ouabain an Membranen des Wildtyp-Enzyms beträgt 44,51 ± 9,69 nM bei einer maximalen Ouabainbindung (Bmax) von 1,09 ± 0,12 pmol/mg Protein. Für die Glu779Asp und Asn776Ile konnten unter den gegebenen Bedingungen weder die Dissoziationskonstante noch die maximale Bindung bestimmt werden. Asp804Asn bindet Ouabain mit geringerer Affinität (K0,5-Wert 104,1 ± 52,18 nM) als der Wildtyp. Membranen mit der Asp807Ala -Mutante haben eine hohe Ouabainaffinität (K0,5-Wert von 10,70 ± 20,03 nM). Die maximale Ouabainbindung jedoch ist sehr gering (0,41 ± 0,21 pmol/mg Protein). Die Asp807Gln -Mutante hat eine sehr viel geringere Affinität als der Wildtyp oder die Mutante Asp807Ala, der K0,5-Wert liegt bei 297,6 ± 18,54 nM Ouabain. Beim Wildtyp wurde ein K0,5- Wert für Kalium von 1,25 ± 0,11 mM bei einer maximalen [3H]Ouabainbindung von 1,50 ± 0,21 pmol/mg Protein berechnet . An den Membranen mit der Glu779Asp-Mutanten konnte keine Veränderung in der Menge des gebildeten [E2*P Ouabain]-Komplexes gemessen werden bei einer ohnehin sehr niedrigen [3H]Ouabainbindung von 0,09 ± 0,08 pmol/mg Protein (vgl. Abb. 45 a). Der K0,5-Wert für K+-Ionen an Membranen mit der Mutanten Asn776Ile ist 0,34 ± 0,04 mM, konnte für die Asp804Asn-Mutante jedoch nicht bestimmt werden. Die spezifische ATPase-Aktivität betrug beim Wildtyp 5,86 ± 0,73 mU/mg Protein. Für die Mutanten Glu779Asp (0,78 ± 2,05 mU/mg Protein), Asn776Ile (1,50 ± 0,30 mU/mg Protein), Asp804Asn (3,01 ± 0,58 mU/mg Protein) sowie Asp807Ala (2,55 ± 0,53 mU/mg Protein) lag der Wert deutlich niedriger. SDS-extrahierte Mikrosomen mit der Mutation Asp807Glu zeigten praktisch keine Aktivität (0,00 ± 0,30 mU/mg Protein). Die Messergebnisse für Glu779Asp deuten darauf hin, dass Glutamat 779 eine wichtige Rolle spielt in der Verbindung der extrazellulären Ionenbindung und der anschließenden intrazellulären Dephosphorylierung des Enzyms. Die Daten aus den Untersuchungen der Mutanten Asn776Ile weisen darauf hin, dass die Selektivität des durch Palytoxin induzierten Ionenkanals erniedrigt worden ist. Im Umkehrschluss bedeutet dies für das Asparagin an Position 776, dass es beteiligt ist an der Ionenerkennung bzw. Ionenkoordination. Zusammenfassend ist für das Aspartat804 zu beobachten, dass durch den Wegfall der negativen Ladung die Affinität für Kalium sinkt und die für Natrium steigt. Aspartat 804 spielt offensichtlich eine wichtige Rolle in der Kaliumkoordination. Dieselbe Aussage scheint auch für die Position 807 zuzutreffen. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die These, dass der durch Palytoxin induzierte Kanal das Ionophor der Natriumpumpe ist, welches in permanent-offener Form arretiert wird. Cardiac glycosides are bound specifically and reversibly to the a- subunit of the Na+,K+-ATPase (Lingrel and Kuntzweiler 1994) and inhibit the activity of the sodium pump. Several cardiac glycosides and aglycones were used to investigate their interaction on three different isoforms of the a-subunit. Sensitivity for Palytoxin was highest for a1b1 (9,5 ± 0,12 nM) and different from that for a2b1 (41,96 ± 0,11 nM) and a3b1 (23,51 ± 0,12 nM). Ouabain-inhibition of the palytoxin-induced K+-efflux was comparable for all isoforms (90,5%, 95,0% and 96,3% for a1, a2 and a3). Ouabagenin and digitoxigenin have shown isoform-specific affinities for the three isoforms, however bufalin had not shown. The impact of structural differences regarding the lactone ring are small and may be due to differences in water solubility. In conclusion: The sugar moiety of the cardiac glycosides is important for their inhibitional function on the sodium pump. The Na+, K+-ATPase (EC 3.6.3.9) belongs to the family of membrane-embedded P-Type-ATPases. Such transport ATPases carry ions through and maintain concentration gradients along the cell. To investigate the role of glutamate 779, asparagin 776, aspartate 804 and aspartate 807 in ion coordination they were changed into homologous and non-homologous amino acids. Glutamate on position 779 was replaced by aspartat. The highly conserved asparagin 776 was mutated to isoleucin. Corresponding to its counterpart in the Calcium-ATPase the negatively charged aspartate 804 was changed into asparagin. On position 807 an aspartatic acid is highly conserved. It was homologous replaced by an glutamic acid and non-homologously replaced by an alanin. The sodium pump mutants were expressed in yeast (Saccharomyces cerevisiae) and analysed for their properties. Yeast cells expressing mutants Glu779Asp were sensitive to palytoxin. Their EC50-value of 0,81 ± 0,08 nM was nine-times lower compared to native sodium pump (7,34 ± 1,67 nM). The respective values for the other mutants were 0,43 ± 0,10 nM (Asn776Ile), 3,62 ± 2,82 nM (Asp807Ala) and 0,28 ± 0,05 nM (Asp807Gln). Dissociations constants (KD) of ouabain for wild type was 44,51 ± 9,69 nM with maximum ouabain binding (Bmax) of 1,09 ± 0,12 pmol/mg protein. The corresponding values obtained from cells expressing Glu779Asp and Asn776Ile were no able to be determined under these conditions. Dissociations constant (KD) for the mutant Asp804Asn was lower compared to native sodium pump (104,1 ± 52,18 nM). The values obtained with mutants Asp807Ala were high (10,70 ± 20,03 nM), however maximum ouabain binding was very low (0,41 ± 0,21 pmol/mg protein). Oubain affinity for mutants Asp807Gln (297,6 ± 18,54 nM) were lower compared to wild type and mutants Asp807Ala. The relative affinity (K0,5- value) of K+ for binding to ouabain was 1,25 ± 0,11 mM for native sodium pump with maximum [3H]Ouabain binding of 1,50 ± 0,21 pmol/mg protein. For mutant sodium pumps Glu779Asp the respective values were no able to be determined while [3H]ouabain binding was very low (0,09 ± 0,08 pmol/mg protein). The K0,5-value of K+ for mutants Asn776Ile was 0,34 ± 0,04 mM, however, for Asp804Asn not be able to be detected under the given conditions. The specific ATPase-activity of wild type was 5,86 ± 0,73 mU/mg protein. The respective values for for mutants were lower: Glu779Asp (0,78 ± 2,05 mU/mg protein), Asn776Ile (1,50 ± 0,30 mU/mg protein), Asp804Asn (3,01 ± 0,58 mU/mg protein) and Asp807Ala (2,55 ± 0,53 mU/mg protein) The specific ATPase-activity of Asp807Glu was undetectable (0,00 ± 0,30 mU/mg protein).Glutamat 779 may play a role as a connecting element between extracellular ion binding and the following intracellular dephosphorylation of the sodium pump. The results of the measurements on Asn776Ile indicate involvement of asparagin 776 in recognition and coordination of the ions. Mutations on position 804 and 807 had shown lower affinities for potassium ions and higher affinities for sodium ions. In conclusion, the aspartic acid residues 804 and 807 respectively may be important for coordination of potassium ions. The results of this thesis support the assumption that the Palytoxin induced ion channel is the ionophor of the sodiumpump which is arrested in a permant open form.