Zytoskelettassoziierte Moleküle und Integrinaktivierung in bovinen Plazentazellen : in vivo und in vitro Studie

Abstract

Integrine sind eine für die Zelladhäsion wichtige Gruppe von transmembranen Glykoproteinrezeptoren aus nicht kovalenten Heterodimeren, welche einerseits mit der extrazellulären Matrix (ECM) interagieren und andererseits für Signaltransduktion in die Zelle verantwortlich sind. Es wurde bereits gezeigt, dass Integrine bei der eingeschränkten Trophoblastinvasion der Rinderplazenta von großer Bedeutung sind. Um die Bedeutung der Signalübertragung über Integrine in der bovinen Plazenta genauer untersuchen zu können, wurde von unserer Arbeitsgruppe eine Primärkultur aus Karunkelepithelzellen etabliert, an der die Integrinuntereinheiten alpha6, alphav, beta1 und beta3 nachgewiesen werden konnten. Mittels der vorliegenden Arbeit werden drei Zielsetzungen verfolgt. Im ersten Teil der Arbeit sollte eine bessere Verfügbarkeit der Primärzellkultur erreicht werden, indem ein Verfahren zur Kryokonservierung der Zellen entwickelt wurde. Diese Methode wurde über den Nachweis der Zytoskelettfilamente & #945;-sm Aktin, Desmin und Zytokeratin, sowie der Expression von Fibronektin, welche mittels indirekter Immunfluoreszenz dargestellt wurden, validiert. Es wurden jeweils die eingefrorenen mit den nativen Zellen verglichen und eine signifikante Dedifferenzierung ausgeschlossen. In dem zweiten Teil der Arbeit sollte die Funktionalität der Integrinbindung nachgewiesen werden, da der reine Nachweis eines Integrinrezeptors nicht ausreicht, um seine Beteiligung an Signalübertragungen zu belegen. Mittels indirekter Immunfluoreszenz wurden zum einen die typischen Fokalkontakte histomorphologisch nachgewiesen und zum anderen durch Doppelmarkierung die Kolokalisationen der Integrinuntereinheit beta1 mit den Signalmolekülen alpha-Aktinin, fokale Adhäsionskinase (FAK), Phosphotyrosin (PT) und Talin, sowie die Kolokalisationen FAK mit PT und Talin detektiert. Alle genannten Moleküle wurden mittels indirekter Immunfluoreszenz sowohl in der Zellkultur als auch im Gefrierschnitt der Plazentome zunächst einzeln nachgewiesen. Die Spezifität der Antikörper gegen die Integrinuntereinheit beta1, alpha-Aktinin, FAK und Talin wurde im Western blot überprüft. In einem dritten Schritt wurde durch das Aussäen der Zellkultur auf mit Fibronektin (FN), Laminin (Lam) und Kollagen IV (Koll) beschichteten 6-Wells im Vergleich zu unbeschichteten Wells untersucht, in wie weit unterschiedliche Matrices das Zellwachstum sowie die Integrin- und Signalmolekülexpression beeinflussen. Der Einfluss auf das Zellwachstum wurde durch eine Auszählung der mit DAPI angefärbten Kerne bestimmt. Die Integrin- und Signalmolekülexpression wurde qualitativ anhand der indirekten Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen die Integrinuntereinheit beta1, alpha-Aktinin, PT und Talin beurteilt. Die Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung der Zellkultur ließ folgende Kolokalisationen erkennen: Entlang der Zell-zu-Zell Kontakte zeigte sich die Integrinuntereinheit beta1 sowohl mit alpha-Aktinin als auch mit FAK kolokalisiert. Die Doppelmarkierung mit PT ergab eine enge Nachbarschaft beider Moleküle. Innerhalb der Fokalkontakte konnte die Integrinuntereinheit beta1 mit Talin und FAK kolokalisiert werden. Des Weiteren wurden Kolokalisationen bei der Doppelmarkierung von FAK mit Talin beziehungsweise mit PT beobachtet. Als Besonderheit ließ sich darstellen, dass die Fokalkontakte am Rand der Zellkolonien zwar Talin, aber kein FAK enthalten. Die Varianzanalyse ergab eine signifikante Verbesserung des Zellwachstums auf allen Beschichtungen im Vergleich zu der unbeschichteten (U) Unterlage (p-Werte: FN vs. U = 0,0001; Lam vs. U = 0,0013; Koll vs. U = 0,0400). Des Weiteren konnte das Wachstum auf Fibronektin als signifikant besser als auf den beiden anderen Beschichtungen nachgewiesen werden (p-Werte = 0,0001). Bezogen auf die Fokalkontakte kam es bei allen untersuchten Signalmolekülen zu einer Vermehrung auf der Fibronektinbeschichtung. Bei Talin war auch eine Vermehrung auf der Kollagen IV- und der Lamininbeschichtung zu erkennen. Mit der vorliegenden Arbeit wurde die Funktionalität der Integrinbindung in der untersuchten Zellkultur nachgewiesen. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die untersuchte Karunkelepithelzellkultur aus tragenden Rindern eine gute Grundlage für weiterführende Untersuchungen der Integrinsignalübertragung darstellt. Von besonderem Interesse sind diesbezüglich feto-maternale Kontaktstudien, die Aufschluss über die Regulation der eingeschränkten Trophoblastinvasion geben können. Integrins are a group of non covalent heterodimeric transmembrane glycoprotein receptors relevant for cell adhesion. On the one hand they interact with the extracellular matrix, on the other hand they are responsible for signal transduction into the cell. It has already been shown that integrins play an important role in the process of restricted trophoblast invasion. In order to study the importance of integrin dependent signal transduction in the bovine placenta, our group recently established a cell culture model of primary caruncular epithelial cells expressing the integrin subunits alpha6, aalphav, beta1 and beta3. The present study focuses on three aims. Firstly, we wanted to achieve a better availability of cultures by establishing a method for cryopreservation. Validation was performed by indirect immunfluorescence detecting the cytoskeletal proteins alpha-smooth muscle (sm) actin, desmin and cytokeratin as well as fibronectin. Major dedifferentiation was ruled out by comparing frozen and native cells. The second aim of the study was to prove the functionality of integrin binding due to the fact that the detection of integrin receptors is not sufficient to prove their participation in signal transduction. The typical focal adhesion signals were histomorphologically assessed by indirect immunfluorescence. Double labeling visualised the colocalisation of integin subunit beta1 with its signaling molecules alpha-actinin, focal adhesion kinase (FAK), phosphotyrosine (PT) and talin, as well as the colocalisation of FAK with PT and talin. All molecules named above were examined in cell cultures as well as on cryosections of the placentome. The specificities of the antibodies detecting integrin subunit beta1, alpha-actinin, FAK and talin were verified by Western blot. A third aim of the study was to investigate the effect of coating culture dishes with fibronectin (FN), laminin (Lam) or collagen IV (Coll) on cell growth as well as integrin and signal molecule expression in comparison to cultures on non coated dishes. The effect on the cell growth was determined by counting nuclei counter stained with DAPI. The integrin and signal molecule expression was assessed qualitatively by indirect immunofluorescence detecting integrin subunit beta1, alpha-actinin, PT and talin.Double labeling showed the following colocalisations in cell culture:Integrin beta1 was colocalised with alpha-actinin and FAK at lateral cell-cell borders. Double labeling of integrin subunit beta1 with PT showed immediate contiguity of both molecules. Within the focal adhesions integrin beta1 was colocalised with talin and FAK. Furthermore, there were colocalisations of FAK with talin and PT, respectively. Nontheless, focal adhesions at the border of cell colonies expressed only Talin and no FAK. Concerning the comparison of cell growth between coated and uncoated (U) cultures the analysis of variance showed significant differences. (p-values: FN vs. U = 0.0001; Lam vs. U = 0.0013; Coll vs. U = 0.0400). Cultures on FN coated dishes had significantly higher nuclei numbers than cultures on Coll or Lam coated dishes (p-values = 0.0001). FN coating lead to an increase of focal adhesions according to the number of fluorescent signals for all signalling molecules examined. Talin expression was additionally increased on Coll and Lam coating. The present study verified the functionality of integrin binding in a cell culture model of primary bovine caruncular epithelial cells from pregnant cows. The results presented are the basis for further studies on integrin binding and signal transduction, in general, and integrin dependent feto-maternal interaction and regulation of restricted trophoblast invasion, in particular.