Entwicklung und Anwendung enzymimmunologischer Verfahren zum Nachweis von Cefalexin, Ceftiofur und Desfuroylceftiofur in Milch

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung und Anwendung enzymimmunologischer Verfahren zum Nachweis der im Hinblick auf die EU-Verordnungen relevanten Cephalosporine Ceftiofur und Cefalexin in Milch.Zur Herstellung immunogener Protein-Konjugate wurde jeweils Cefalexin bzw. Ceftiofur mittels Glutardialdehyd an ein Trägerprotein (KLH) gekoppelt. Jeweils vier Kaninchen wurden mit dem Cefalexin-KLH-Konjugat (1,7 mg/Tier) bzw. dem Ceftiofur-KLH-Konjugat (2,3 mg/Tier) immunisiert. Zur Herstellung von Antigen-Enzymkonjugaten wurden Cefalexin bzw. Ceftiofur mittels Carbodiimid an Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert. Ceftiofur-Proteinkonjugate als Festphasenantigene für den kompetitiven indirekten Enzymimmuntest (EIA) wurden durch Kopplung von Ceftiofur an BSA mittels Carbodiimid bzw. mittels Glutardialdehyd hergestellt.Mit dem Cefalexin-HRP-Konjugat und den verschiedenen Kaninchen-Antiseren wurden kompetitive direkte EIAs erstellt. Es zeigte sich, dass der direkte EIA unter Verwendung gefällter Antiseren als Beschichtung das empfindlichste Testsystem mit einer mittleren Nachweisgrenze für Cefalexin von 0,2 ±± 0,1 µg/kg darstellte (Antiserum Kaninchen 4). Der Nachweis von Cefalexin im kompetitiven direkten EIA unter Verwendung der DASP-Technik erbrachte im Vergleich dazu keine Verbesserung der Testempfindlichkeit. Mit dem Ceftiofur-HRP-Konjugat und den verschiedenen Kaninchen-Antiseren wurden kompetitive direkte EIAs auf Basis der DASP-Technik erstellt. Mit dem Ceftiofur-BSA-Konjugat und den verschiedenen Kaninchen-Antiseren wurden kompetitive indirekte EIAs erstellt. Der indirekte EIA unter Verwendung von Ceftiofur-C-BSA als Beschichtungs-antigen erwies sich als empfindlichstes Testsystem, mit einer mittleren Nachweisgrenze für Ceftiofur von 1,9 ±± 1,0 mg/kg (Antiserum Kaninchen 5) bzw. 3,3 ±± 1,1 müg/kg (Antiserum Kaninchen 6). Zur Bestimmung der Spezifität des kompetitiven direkten EIA zum Nachweis von Cefalexin bzw. des kompetitiven indirekten EIA zum Nachweis von Ceftiofur wurde der Einfluss anderer Cephalosporine sowie strukturähnlicher Penicilline auf die Testsysteme untersucht. Hierzu wurden ca. 30 Substanzen, darunterunter anderem auch chemisch (hydrolytisch) oder enzymatisch (Penicillinase) gespaltene Antibiotika sowie durch chemische Derivatisierung von Ceftiofur hergestellte Metaboliten (Desfuroylceftiofur = DFC, Desfuroylceftiofur-Acetamid = DFA) getestet. Die EIAs zum Nachweis von Cefalexin zeigten in Abhängigkeit vom verwendeten Antiserum (Kaninchen 3 bzw. Kaninchen 4) neben der Reaktion mit Cefalexin eine relative Kreuzreaktion mit den in der Veterinärmedizin nicht zugelassenen Cephalosporinen Cefaclor (31 % bzw. 53 %), Cefadroxil (55 % bzw. 22 %) und Cephradin (82 % bzw. 73 %). Das Testsystem erwies sich somit unter praktischen Gesichtspunkten als spezifisch für den Nachweis von Cefalexin in Milch. Die EIAs zum Nachweis von Ceftiofur zeigten in Abhängigkeit vom verwendeten Antiserum (Kaninchen 5 bzw. Kaninchen 6) unterschiedliche Kreuzreaktivität. Bei Verwendung des Antiserums von Kaninchen 5 erwies sich das Testsystem als hochspezifisch für Ceftiofur. Bei Verwendung des Antiserums von Kaninchen 6 zeigten sich neben der Reaktion mit Ceftiofur relative Kreuzreaktionen mit den in der Veterinärmedizin nicht zugelassenen Cephalosporinen Cefotaxim (10 %), Cefuroxim (20 %) und Ceftriaxon (29 %), sowie mit Ceftiofur-Metaboliten (5 %). Hier wurde eine mittlere Nachweisgrenze für den Ceftiofur-Hauptmetaboliten DFC von 100 ±± 50 müg/kg ermittelt. Die Kombination beider Testsysteme für Ceftiofur ermöglicht somit eine Differenzierung des Rückstandsgehaltes an Ceftiofur-Muttersubstanz und Metaboliten in Milch. Die praktische Anwendbarkeit der entwickelten EIAs wurde an künstlich kontaminierter, wärmebehandelter Vollmilch und an Rohmilch geprüft. Milchproben wurden durch Zentrifugieren entfettet und ohne weitere Aufbereitung in den kompetitiven direkten EIA zum Nachweis von Cefalexin bzw. den kompetitiven indirekten EIA zum Nachweis von Ceftiofur eingesetzt (Dotierung jeweils 10 -bis 200 ng/ml). Die Wiederfindungsraten für Cefalexin lagen in wärmebehandelter Vollmilch bei 100,1 % bis 128,6 % und in Rohmilch bei 105,3 % bis 132,0 %. Die Wiederfindungsraten für Ceftiofur lagen in wärmebehandelter Vollmilch bei 88,0 % bis 109,4 % und in Rohmilch bei 103,4 % bis 138,7 %. Die praktische Anwendbarkeit der entwickelten EIAs zum Nachweis von Ceftiofur wurde zusätzlich bei Anlieferungsmilchproben im Rahmen der Güteprüfung durch den HVL und in einem Anwendungsversuch zum Ausscheidungsverhalten von Ceftiofur und Ceftiofur-Metaboliten nach therapeutischer Applikation eines cCeftiofurhaltigen Präparates bei laktierenden Rindern überprüft. Die hier vorgestellten EIAs erwiesen sich als gut geeignet zum Rückstandsnachweis dieser beiden Verbindungen entsprechend Verordnung (EWG) Nr. 2377/90. Die Nachweisbarkeit beider Verbindungen lag jeweils deutlich unterhalb der Höchstmenge (MRL: 100 µg/kg). This paper describes the development and application of enzyme immunoassays (EIAs) for the detection of cefalexin and ceftiofur in bovine milk, with regard to the relevant EU-regulations. For the production of immunogenic protein-conjugates, cefalexin or ceftiofur were each coupled to a carrier-protein (KLH) using glutardialdehyde as the coupling reagent. The cefalexin-KLH-conjugate (1.7 mg/animal) respectively the ceftiofur-KLH-conjugate (2.3 mg/animal) wereere used to raise antibodies in two groups of each four rabbits. In order to generate antigen-enzyme-conjugates, the conjugation of cefalexin or ceftiofur to HRP was achieved by a carbodiimide procedure. The synthesis of solid-phase-antigens was achieved by coupling ceftiofur to BSA using as well carbodiimide procedure as glutardialdehyde procedure. Using the cefalexin-HRP-conjugate and the different rabbit-antisera, competitive direct EIAs were developed. An EIA employing antiserum of one animal (rabbit 4) as the coating-antibody proved to be the most sensitive approach, with an average detection limit for cefalexin of 0.2 ±± 0.1 müg/kg. In comparison, no improvement of sensitivity could be achieved for the detection of cefalexin in a competitive direct EIA using a DASP-technique. Using the ceftiofur-HRP-conjugate and different rabbit-antisera, competitive direct EIAs based on DASP-technique were also developed. However, when using the ceftiofur-BSA-conjugate as the coating-antigen in competitive indirect EIAs, this approach was found to yield the most sensitive test system, with average detection limits determined for ceftiofur of 1.9 ±± 1.0 müg/kg and 3.3 ±± 1.1 µg/kg, using serum of rabbit 5 and rabbit 6, respectively. To check specificity of the competitive direct EIA for the detection of cefalexin and the competitive indirect EIA for the detection of ceftiofur, other cephalosporins and structurally related penicillins were tested under the conditions of each immunoassay. A total of about 30 substances was tested, among these some chemically (hydrolysis) or enzymatically (penicillinase) cleaved antibiotics, as well as chemically modified analogues of ceftiofur (e.g., desfuroylceftiofur = DFC, desfuroylceftiofur-acetamide = DFA). The assays for cefalexin showed, depending on the antisera used, relative cross reactions (cefalexin = 100%) with some cephalosporins, which are, however, not approved for use in veterinary medicine: cefaclor (antiserum rabbit 3: 31 %; antiserum rabbit 4: 53 %), cefadroxile (55 %; 22 %) and cephradine (82 %; 73 %). Under practical considerations, the EIA for cefalexin was specific for the detection of cefalexin in milk. For ceftiofur specificity varied depending on the antisera used (rabbit 5 or rabbit 6). When using the antiserum from rabbit 5, the competitive indirect EIA was highly specific for ceftiofur. When using the antiserum from rabbit 6 there were cross-reactions with cefotaxime (10 %), cefuroxime (20 %) and ceftriaxone (29 %). These substances are not approved for use in veterinary medicine. More important was that DFC also cross-reacted (5%) in this test version. For this compound, which is the major metabolite of ceftiofur in milk, an average detection limit of 100 ±± 50 müg/kg was found. The combination of both EIA test systems for the detection of ceftiofur therefore enables a differentiation between residues of the parent compound (ceftiofur) and those of the metabolite (DFC) in milk. The applicability of the EIAs was studied using artificially contaminated milk (pasteurized milk, raw bovine milk, contamination levels 10 - 200 ng/ml each). The samples were defatted by centrifugation and then assayed, without any further treatment, both in the competitive direct EIA for the detection of cefalexin and in the competitive indirect EIA for the detection of ceftiofur. The recovery of cefalexin from pasteurized milk was between 100.1 % and 128.6 %, in raw milk between 105.3 % and 132.0 %, respectively. The recovery of ceftiofur from pasteurized milk was between 88.0 % and 109.4 %, in raw milk between 103.4 % and 138.7 %, respectively. The applicability of the EIAs for the detection of ceftiofur was further tested by analysing inhibitor-positive bulk milk samples obtained from the german milk ordinance and by testing samples of an application trial to investigate the excretion behaviour of ceftiofur and its metabolites after therapeutic treatment of dairy cattle. The EIAs described here were found to be suitable for the detection of the cephalosporin antibiotics cefalexin and ceftiofur/ceftiofur metabolites in milk. The detection limits of these assays in milk were well below the requirements of European Union regulation 2377/90 concerning maximum residue limits (MRL) for these compounds in milk (MRL: 100 µg/kg).