Molecular investigations of peptidoglycan-binding proteins in Listeria monocytogenes

Abstract

The peptidoglycan layer of gram-positive bacteria contains various components that are crucial for interactions with the environment and for host invasion. In this study, the gram-positive pathogen Listeria monocytogenes was used to study the importance of three cell wall constituents for viability and virulence: the cell-wall degrading murein hydrolases (autolysins), teichoic acids and lipoproteins.The first section of this study addresses cell wall hydrolases and their role in deter-mining the morphology, stability and activity of the bacterial cell. Numerous reports have previously documented the spontaneous generation of rough strains from otherwise smooth colonies isolated from clinical samples or the environment. Here I identify the molecular basis of this transition by examining two murein hydrolases, MurA (murA) and p60 (iap), whose activity are critical for this transition. Whereas single mutation of the respective genes results in a smooth phenotype with chains of bacterial cells, double mutation generates rough colony morphology. Combinatory deletions of each autolysin with other known hydrolases in L. monocytogenes (Ami, Auto and p45) were assessed for the smooth-rough transition. None of these mutants exhibit a rough phenotype or altered cell morphology. It was observed that strains lacking murA, iap or ami display altered abilities in autolysis, ethanol tolerance, flagellar motility and biofilm formation. Bioinformatic analysis of the listerial genome was used to identify proteins with putative murein hydrolase activity. Characterization of respective deletion mutants revealed that none exhibit changes in morphology or in lytic activity. However, all newly generated bacterial strains are more vulnerable to ethanol stress when compared to their parental strain. For some mutants, impaired flagellar motility and decreased host invasion could also be observed.The second part of my thesis deals with the modulation of teichoic acids via incorporation of D-alanine to resist attack by cationic antimicrobial peptides (CAMPs). The VirR/S regulon of L. monocytogenes has been shown to control various genes, among those resistance genes for CAMPs, dltA-D and mprF. Deletion mutants lacking corresponding genes were generated to determine their sensitivity towards CAMPs and their function in host invasion. Using quantitative RT-PCR, the dltB and mprF genes were found to be up-regulated in L. monocytogenes EGDe in the presence of CAMPs. The virR and virS deletion strains have decreased tolerance to various cationic peptides. They also display very low invasion rates in Caco2 cells but wild-type-like rates in Hela cells. This discrepancy may be due to the different abilities of Caco2 and Hela cells to produce cationic peptides. These data suggest that the VirR/S two-component system is involved in the control of the dlt and mprF resistance genes when L. monocytogenes is in the presence of cationic peptides.The final section of my thesis examines the role of lipoproteins for listerial virulence and host immune activation. Recently, a deletion strain of L. monocytogenes lacking the prolipoprotein diacylglyceryl transferase (lgt) gene was generated that is unable to produce lipoproteins due to the loss of diacylglycerol modification activity. The absence of lipoproteins on the bacterial surface renders the strain insensitive to TLR2 recognition and host cells exposed to mutant lgt bacteria show highly delayed proinflammatory cytokine production. Infection studies of wild-type and TLR2-deficient mice demonstrate attenuation of the lgt deletion mutant, implying multiple roles of lipoproteins during infection. Further characterization of the lgt mutant revealed that it is impaired in both invasion and intracellular survival, and that it exhibits increased susceptibility to cationic peptides and ethanol. Lipoproteins are identified as the immunologically active ligands of TLR2 and as relevant contributors to the pathogenicity at various stages of infection. In dieser Studie wurde das gram-positive Bakterium Listeria monocytogenes verwendet, um die Bedeutung dreier Oberflächenkomponenten für Überlebensfähigkeit und Virulenz zu untersuchen: Zellwandhydrolasen, Teichonsäuren und Lipoproteine.Der erste Abschnitt dieser Studie umfasst Zellwandhydrolasen und ihre Rolle für die Bestimmung der Morphologie, Stabilität und Aktivität der Bakterienzelle. In zahlreichen Publikationen wurde über die spontane Entstehung von rauen Stämmen aus glatten Kolonien berichtet, die aus klinischen Isolaten oder aus der Umwelt isoliert wurden. Durch die Identifizierung von zwei Mureinhydrolasen, MurA und p60, deren Aktivität entscheidend für die Entstehung des rauen Phänotypen ist, wird hiermit die molekulare Grundlage über diesen Wechsel festgelegt. Während Einzelmutanten dieser Gene einen glatten Phänotyp mit Zellketten aufweisen, führt die Doppelmutation zu einer rauen Morphologie. Zudem wurden Deletionen der beiden Autolysine mit anderen bereits bekannten Hydrolasen in L. monocytogenes (Ami, Auto and p45) durchgeführt, um festzustellen, ob es zu einem Wechsel von glatt zu rau kommt. Es stellte sich heraus, dass keine dieser Mutanten einen rauen Phänotypen oder eine veränderte Zellmorphologie aufweist. Jedoch zeigen die Stämme ohne die Gene murA, iap oder ami veränderte Eigenschaften bei der Autolyse, bei Toleranz gegenüber Ethanol, bei Motililtät mittel Flagellen und bei der Bildung von Biofilmen. Anhand von Computeranalysen des Listeriengenoms wurde zudem nach anderen Mureinhydrolasen gesucht. Eine Charakterisierung entsprechender Deletionsmutanten zeigte jedoch, dass keine dieser Stämme Abweichungen in der Morphologie, dem lytischen Proteinprofil oder in ihrer Autolyseaktivität aufweist. Hingegen, erwiesen sich fast alle dieser Bakterienstämme als sensibler gegen Ethanol im Vergleich zu ihrem Wildtypen. Eine Verminderung der Flagellinmotilität und eine Attenuierung der Wirtsinvasion konnte zudem bei einigen Mutanten beobachtet werden.Der zweite Abschnitt der Doktorarbeit befasst sich mit der Modulation von Teichonsäuren durch den Einbau von D-Alanin, wodurch die Zelle resistenter gegen Angriffe von kationischen antimikrobiellen Peptiden (CAMPs) wird. Es wurde gezeigt, dass das VirR/S Regulon von L. monocytogenes verschiedene Gene kontrolliert, unter anderem auch die Resistenzgene gegen CAMPs, dltA-D and mprF. Deletionsmutanten entsprechender Gene wurden hergestellt, um ihre Empfindlichkeit gegen CAMPs zu bestimmen und ihre Bedeutung für die Wirtsinvasion zu untersuchen. Durch quantitative RT-PCR wurde festgestellt, dass dltB und mprF unter Einfluß von CAMPs hochreguliert werden. Die virR und virS Mutanten haben eine stark verminderte Toleranz für kationische Peptide. Sie weisen zudem sehr geringe Invasionsraten in Caco2 Zellen auf, haben aber ähnliche Invasionsraten in Helazellen wie der Wildtyp. Diese Abweichung könnte an einer unterschiedlichen Fähigkeit von Caco2 und Hela- Zellen, kationische Peptide zu produzieren, liegen. Diese Daten unterstützen die Annahme, dass der VirR/S Regulator ein Sensorsystem für kationische Peptiden ist und die Resistenzgene dlt und mprF kontrolliert.Der letzte Teil meiner Doktorarbeit untersucht die Bedeutung von Lipoproteinen für die Virulenz von Listerien und der Immunaktivierung des Wirtesimmunsystems. Vor kurzem wurde eine Deletionsmutante von L. monocytogenes hergestellt, der das Gen für die Prolipoprotein Diacylglyceryl Transferase (lgt) fehlt. Dieser Stamm besitzt nicht die Fähigkeit, Lipoproteine herzustellen, da die Diacylglycerol-Modifizierung nicht mehr stattfindet. Das Fehlen der Lipoproteine auf der Bakterienoberfläche macht den Stamm unempfänglich für eine TLR2-Erkennung. Gleichzeitig zeigten Wirtszellen, die der lgt-Mutante ausgesetzt waren, eine stark verzögerte proinflammatorische Cytokinausschüttung. Infektionsversuche mit Wildtyp und TLR2-defizienten Mäusen zeigen außerdem eine Attenuierung der lgt Deletionsmutante und demonstrieren damit, dass Lipoproteine während der Infektion viele unterschiedliche Aufgaben haben. Eine nähere Charakterisierung der lgt Mutante ergab, dass der Stamm ein verringertes Invasions- und Replikationsvermögen besitzt und eine erhöhte Empfindlichkeit für kationische Peptide und Ethanol aufweist. Hiermit wird gezeigt, dass Lipoproteine immunologisch aktive Liganden für TLR2 sind und einen Beitrag zur Pathogenität in verschiedenen Infektionsstadien leisten.