Expression von extrazellulärer RNase und Analyse ihrer Aktivität in Endothelzellen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die Expression von RNase 1 und Angiogenin (= RNase 5) auf mRNA- und Proteinebene sowie die RNase-Aktivität in makro- und mikrovaskulären EC mittels RT-PCR, Western Blot und RNase-Aktivitätstest untersucht. Die Befunde zeigten, dass die RNase 1- und Angiogenin-Expression auf mRNA- und Proteinebene sowie die RNase-Aktivität in makro- und mikrovaskulären EC unterschiedlich ist. Makrovaskuläre Nabelschnur-EC (HUVEC) exprimieren RNase 1, sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene, viel stärker als mikrovaskuläre EC (HBMEC, BMEC) und sezernieren diese hauptsächlich in den Überstand. In HBMEC hingegen ließ sich das Enzym im Zelllysat, aber kaum in den Überständen nachweisen. Im Gegensatz dazu war zu beobachten, dass Angiogenin wesentlich stärker in HBMEC als in HUVEC exprimiert ist und dass es nahezu vollständig in den Überstand sezerniert wird. Nach 24-stündiger Stimulation der HUVEC und HBMEC mit proinflammatorischen Agenzien (LPS, TNFalpha), prokoagulatorischen (RNA, Poly IC) und antikoagulatorischen (aktiviertes Protein C, 5-Nitrosoglutathion) Regulatoren sowie Wachstumsfaktoren (VEGF, bFGF) wurde die Expression von RNase 1 und Angiogenin auf mRNA- oder Proteinebene nicht signifikant verändert. Dagegen bewirkte die Behandlung von HUVEC mit dem anti-angiogen und anti-inflammatorisch wirkenden bakteriellen Faktor Eap eine deutliche Zunahme der RNase 1-Expression in den Überständen bei gleichzeitiger Abnahme der Angiogeninexpression auf Proteinebene, jedoch keine Expressionsänderung auf mRNA-Ebene. Ferner führte die Stimulation mit Thrombin zu einer leichten Abnahme der RNase 1-Expression in HUVEC-Überständen auf Proteinebene. Die Überprüfung der EC auf ihre RNase-Aktivität zeigte, dass diese in den makrovaskulären HUVEC-Überständen weitaus höher war (> 10-fach) als in den mikrovaskulären EC. In den Lysaten aller untersuchten EC war kaum RNase-Aktivität detektierbar. Die von HUVEC sezernierte RNase-Aktivität wurde durch die verwendeten Stimulanzien auf unterschiedliche Weise verändert. So führte eine 24-stündige Stimulation der HUVEC mit Poly IC, RNA, TNFalpha sowie Thrombin zu einer beachtlichen Abnahme der RNase-Aktivität in den Überständen, während durch LPS, VEGF, Eap und zyklischem RGD keine signifikante Aktivitätsänderung zu beobachten war. Eine leichte RNase-Aktivitätszunahme zeigte sich nach der Behandlung mit den Wachstumsfaktoren bFGF bzw. bFGF zusammen mit VEGF, eine stärkere Zunahme war zu beobachten durch die Stimulation mit dem antikoagulatorisch wirkenden aktivierten Protein C, dem Aggregations-hemmenden 5-Nitrosoglutathion sowie nach 24 h Hypoxie. Zusammenfassend lässt sich aus den gezeigten Ergebnissen schlussfolgern, dass die RNase-Aktivität, stärker als die RNase-Expression, unter verschiedenen Bedingungen induzierbar bzw. hemmbar ist. Welche Rolle dies bei physiologischen Prozessen bzw. unter pathologischen Zuständen, wie z.B. bei gesteigerter Thrombusbildung, spielt, bleibt in weiteren Untersuchungen aufzudecken. In the present work the expression of RNase 1 and angiogenin (= RNase 5) on mRNA- and protein level as well as RNase-activity were investigated in micro- and macrovascular EC by RT-PCR, Western blotting and RNase-activity-test. The results showed that RNase 1- and angiogenin expression on mRNA- and protein level as well as RNase-activity in macro- and microvascular EC are different. Makrovascular EC of umbilical cord (HUVEC) express much more RNase 1 than microvascular EC (HBMEC, BMEC) on both mRNA- and protein level and secret this enzyme into the supernatant mainly. However, in HBMEC RNase 1 was detected in the celllysates, but hardly in the supernatant. In contrast, angiogenin expression was found to be much stronger in HBMEC than in HUVEC and the majority of this protein was secreted into the supernatant. After 24 h stimulation of HUVEC and HBMEC with proinflammatory agents (LPS, TNFalpha), procoagulant (RNA, Poly IC) and anticoagulant (activated protein C, 5-Nitrosoglutathion) regulators as well as growth factors (VEGF, bFGF), no significant change of RNase 1- or angiogenin expression could be observed on mRNA- or protein level. Though, treatment of HUVEC with the anti-angiogenic and anti-inflammatory bacterial factor Eap showed a clear increase of RNase 1-expression in the supernatant, whereas a decrease of angiogenin expression was observed at the same time on protein level, without any alteration of expression on mRNA-level. Moreover, stimulation with thrombin led to a moderate decrease of RNase 1-expression in HUVEC-supernatant on protein level. Investigations on RNase-activity in EC showed that this activity is much higher (> 10-fold) in the macrovascular HUVEC-supernatant than in microvascular EC. In the celllysates of all tested EC there was almost no RNase-activity detectable. RNase-activity secreted by HUVEC was modulated by the used agents in different ways. Thus, 24 h stimulation of HUVEC with Poly IC, RNA, TNFalpha and thrombin led to a remarkable decrease of RNase-activity in the supernatant, whereas no significant change in activity was observed through treatment with LPS, VEGF, Eap and cyclic RGD. A weak increase of RNase-activity was induced by treatment with the growth factors bFGF and bFGF together with VEGF, stronger increases were observed by stimulations with the anticoagulant activated protein C, by 5-Nitrosoglutathion, which is known to have an anti-aggregatory function as well as after 24 h hypoxia. Conclusively, the presented results suggest, that RNase-activity, more than RNase-expression is induced and inhibited respectively under different conditions. It remains to be established by further investigations, which role this might play in physiological processes or under pathological states, such as increased thrombus formation.