Beeinflussung der Stabilisierung von HIF-1 alpha in HepG2-Zellen und ihrer Vitalität durch Zitratzyklusmetabolite in einem Organtransplantationsmodell

Abstract

Trotz steigender Zahlen bei den Lebertransplantationen wird nur wenig mehr als die Hälfte der Patienten ein Spenderorgan bekommen, welche eines benötigen. Einer der Hauptfaktoren, welche den Erfolg einer Organtransplantation limitieren, ist der Ischämie/Reperfusionsschaden. Hinter diesem Begriff steht eine Vielzahl von Schädigungen des Transplantats, vor allem auf zellulärer Ebene, welche durch die Organentnahme, den Transport und die darauf folgende Implantation bedingt sind. Um Organe vor Ischämie/Reperfusionsschäden zu alpha schützen wurden spezielle Konservierungslösungen etnwickelt und ständig verbessert. In Europa sind zur Zeit vor allem die Organkonservierungsslöungen Celsior, HTK und UW in Verwendung. Versuche der Arbeitsgruppen um Hohl und Wiesner Ende der 1980er Jahre an Rattenherzen, zeigten, dass die Zugabe der Zitratzyklusmetabolite -Ketoglutarat, Malat und Fumarat unter Hypoxie zu einer erhöhten Succinatbildung führte und sich protektiv auf die von Wiesner et al. verwendeten ischämischen Rattenherzen auswirkte. Daher war es ein Ziel dieser Arbeit herauszufinden, ob das von Wiesner verwendete Modell auch Hepatozyten übertragbar ist. Der Transkriptionsfaktor HIF-1 ist ein zentrales Molekül der Hypoxieantwort. Wir haben in einem Zellkulturmodell seine alpha Untereinheit (HIF-1alpha), welche sauerstoffabhängig reguliert wird, im Westernblotverfahren nachgewiesen. Es wurde untersucht ob der Zusatz der Zitratzyklusmetabolite Malat, Fumarat und Succinat zu drei verschiedenen Organkonservierungslösungen (Celsior, HTK oder UW) einen Einfluss auf die HIF-1alpha-Stabilisierung in HepG2-Zellen und die Vitalität von HepG2-Zellen hat. Als Modell wurde die humane Hepatomzelllinie HepG2 verwendet. Die Zellen wurden für die Versuchsdurchführung allen für eine Organtransplantation wichtigen Bedingungen (Normoxie/Hypoxie 37°C und Normoxie/Hypoxie 4°C) ausgesetzt. Danach bestimmten wir die HIF-1-Proteinmenge quantitativ im Western Blot und die Vitalität der Zellen mit Hilfe eines MTT-Tests.Die Zugabe der Zitratzyklusmetabolite Malat, Fumarat und Succinat zu den drei Organkonservierungslösungen führte unter den unterschiedlichen Versuchsbedingunegn zu keiner signifikanten Änderung der HIF-1alpha-Stabilisierung. Die Zugabe von Succinat führt jedoch unter 4°C Normoxie in Celsior, HTK und UW, sowie unter 4°C Hypoxie in Celsior und HTK zu einer signifikanten Erhöhung der Zellvitalität. In Celsior nimmt die Zellvitalität nach Zugabe von Succinat unter 4°C Normoxie im Median um 53 % zu und unter 4°C Hypoxie im Median um 38 % zu. Signifikante Unterschiede bestehen zwischen Celsior, HTK und UW nach Zugabe von Succinat nicht. Die Organkonservierungslösung Celsior ist uns während der Versuche durch zwei Eigenschaften besonders aufgefallen. Sie präserviert unter 37°C Normoxie über 6 Stunden, also unter warmen Versuchsbedingungen, die HepG2-Zellen genauso gut wie das von uns verwendete Zellkulturmedium DMEM+Z. Zudem bewirkt der Zusatz von Succinat sowohl unter 4°C Normoxie als auch unter 4°C Hypoxie eine Erhöhung der Zellvitalität. Der Zusatz von Succinat zu Organkonservierungslösungen, speziell zu Celsior, hat in kalten Temperaturen einen protektiven Effekt auf Hepatozyten. Zudem präserviert Celsior Hepatozyten sehr gut bei warmen Temperaturen. In weiteren Studien muss nun nachgewiesen weren, ob die Zugabe von Succinat auch im Rahmen einer in vivo Lebertransplantation einen besonders protektiven Effekt auf die Hepatozyten hat und somit den Schaden am Organ durch die Entnahme, den Transport und die Reperfusion verringert. Despite of rising number of transplanted livers, only about fifty percent of the patients who need a new liver will receive one. One of the main factors limiting the success of organ transplantation is the ischemia/reperfusion injury. Ischemia/reperfusion injury means a multitude of primarily cellular damage, which occurs during the different phases of organ transplantation. Since the 1980´s special transplantation solutions has been developed and constantly improved to prevent organs from ischemia/reperfusion injury. Celsior, UW and HTK are the common transplantation solutions of Europe. In the end of the 1980´s Wiesner and Hohl showed that the perfusion of hypoxic or ischemic myocardium with the Krebs cycle intermediates alpha-ketoglutarate, fumarate and malate leads to an increased formation of succinate and improves the outcome of the ischemic myocardium. We tried to prove that the addition of fumarate, malate and succinate to transplantation solutions in a cell culture model would lead to similar effects on liver cells. In hypoxia HIF-1, a transcription factor, is one of the most important regulatory proteins. In an organ transplantation model it´s oxygen-dependent controlled alpha subunit, HIF-1alpha, was quantified by westernblot. We examined if the addition of the Krebs cycle intermediates fumarate, malate, and succinate to three common transplantation solutions (Celsior, UW and HTK) has an influence on the HIF-1alpha-stabilization in HepG2-cells and/or their viability. We used the human hepatoma cell-line HepG2 in our cell culture model and incubated the cells under the different critical conditions of transplantation (4°C and 37°C, hypoxia and normoxia). After incubation we quantified either HIF-1alpha in westernblot or the cell viability in a MTT-test. The addition of the Krebs cycle intermediates malate, fumarate and succinate to the transplantation solutions had no significant influence on the stabilization of HIF-1alpha under the different experimental conditions.The addition of succinate leads to a higher cell viability in Celsior, HTK, and UW under 4°C normoxia and in Celsior and HTK under 4°C hypoxia. Even if there are no statistical significant differences between the three transplantation solutions, there is an remarkable increase in the cell viability in Celsior up to 53 % under 4°C normoxia and 38 % under 4°C hypoxia. One of the transplantation solutions, Celsior, came to our special interest. In the preservation of HepG2-cells over 6 h under 37°C normoxia Celsior turned out as good as our cell culture medium DMEM+Z. In Celsior the addition of succinate leads to higher cell viability not only in 4°C normoxia but also in 4°C hypoxia. Under cold conditions, the addition of succinate to transplantation solutions, especially Celsior, has a protective effect on hepatocytes. In 37°C normoxia Celsior preserves hepatocytes as good as DMEM+Z. Now it has to be confirmed in further studies, if the addition of Succinate to transplantation solutions prevents hepatocytes from ischemia/reperfusion injury in a in vivo organ tranplantation, too.