Molekulargenetische Untersuchungen zur Mikrochimärismusdiagnostik

Abstract

In dieser Arbeit wurde eine weitere - neben der routinemäßig durchgeführten Short-Tandem-Repeats-Polymorphismus-Analyse (STR) - PCR-basierte Methode zur Mikrochimärismus-diagnostik nach allogener Stammzell-Transplantation, die mit hoher Sensitivität einfach und schnell durchführbar ist, entwickelt und anhand von klinischen Beispielen überprüft. Es wurde gezeigt, dass der Nachweis mitochondrialer DNA sensitiver ist als der Nachweis nukleärer DNA. Mittels PCR-SSP wurde unter Verwendung mitochondrialer Sequenzpolymorphismen eine Sensitivitätssteigerung gegenüber dem Nachweis nukleärer Polymorphismen um den Faktor 1000 erreicht. Diese Sensitivitätssteigerung konnte mittels PCR-SSP bei allen standardisierten Verdünnungsreihen künstlich erstellter Chimären durch einen Wechsel von nukleären zu mitochondrialen DNA-Polymorphismen gezeigt werden. Allerdings hat die erhöhte Sensitivität beim Nachweis mitochondrialer DNA-Polymorphismen eine geringere Spezifität der Reaktion zur Folge und erfordert daher mindestens zwei Sequenzunterschiede zwischen Spender und Empfänger. So ist der Nachweis mitochondrialer DNA-Polymorphismen mit Beachtung oben genannter Voraussetzungen hochsensitiv. Beim Vergleich zwischen der klassischen PCR-SSP und der Light-Cycler PCR war zum Nachweis desselben Polymorphismus die Sensitivität beider Verfahren gleich. Im Weiteren wurde an realen Spender-Empfängerpaaren die Eignung verschiedener polymorpher Genorte zur Mikrochimärismusdiagnostik durch Vergleich mit der routinemäßig durchgeführten STR-Analyse überprüft. Bei allen untersuchten Paaren wurde ein hämatopoetischer Spenderchimärismus nachgewiesen und es zeigte sich eine völlige Übereinstimmung der Ergebnisse. Durch frühzeitige Bestimmung des geeignesten Polymorphismus kann eine Rezidivbestimmung mittels der hier vorgestellten PCR-SSP bzw. LightCycler-PCR erfolgen. Insgesamt konnte eine neue, breit einsetzbare PCR-basierte sensitive Nachweis-Methode für die Mikrochimärismusdiagnostik erarbeitet werden, die, wie im zweiten Teil der Arbeit gezeigt wurde, auch in der klinischen Routine problemlos eingesetzt werden kann. In this thesis, an additional to the in routine-used Short-tandem-repeats-polymorphism- analysis PCR-based high sensitive method for the detection of microchimerism after allogenic stemcell-transplantation was investigated. This simple and quick method was validated using clinical examples. It was shown that the detection of mitochondrial DNA is more sensitive than the detection of nucleic DNA. By means of PCR-SSP under utilization of mitochondrial sequencepolymorphisms an increasing sensitivity (factor 1000) in contrast to nucleic gene polymorphisms was received. This increase in sensitivity could be found by using PCR-SSP in all standardized dilution series of artificially produced donor chimeras because of a change from nucleic to mitochondrial DNA-polymorphisms. However, the higher sensitivity by detection of mitochondrial DNA-polymorphisms has shown a lower specifity of the reaction and requires at least two differences of the sequences between donor and receiver sequences. The detection of mitochondrial DNA-polymorphisms considering the named conditions is high-sensitive. In comparison between using the classical PCR-SSP and the Light-Cycler PCR for the detection of the same polymorphism the sensitivity was equal. The suitability of a selection of polymorphic gene locus for the qualitative analysis of microchimerism to real donor-receiver pairs was studied in comparison with the Short-tandem-repeats diagnostic, which was done in clinical routine. In all investigated pairs a haematopoetic donor chimerism was demonstrated and a total congruency of the results was found. By early determination of the most suitable polymorphism the detection of relapse can be carried out with the represented PCR-SSP and LC-PCR method. In conclusion, a new PCR-based method for the analysis of microchimerism was demonstrated. This can be applied without any difficulty in daily clinical routine as shown in the second part of this thesis.