Untersuchungen zur Verbreitung und Funktion des äußere-Membran-Proteins OmpW von Salmonella spp.

Abstract

Die Proteine der äußeren Membran von Salmonellen sind geeignete Targetstrukturen für diagnostische, therapeutische oder immunprophylaktische Anwendungen. Vor diesem Hintergrund war es Ziel der vorliegenden Arbeit, das Vorkommen des äußeren-Membran-Proteins W (OmpW) von Salmonella spp. erstmals systematisch zu untersuchen. Des Weiteren sollte mittels einer isogenen ompW-Knockout-Mutante beleuchtet werden, inwieweit OmpW ein essentieller Vitalfaktor für Salmonellen ist. Im Einzelnen sollte nach Hinweisen gesucht werden, welche biologische Bedeutung OmpW für Salmonellen hat und welchen Einfluss das Fehlen von OmpW auf die Fitness der Salmonellen unter verschiedenen Milieueinflüssen ausübt. Eine repräsentative Auswahl an 100 Salmonellen-Stämmen aus beiden Spezies, allen Subspezies und 19 verschiedenen O-Gruppen sowie 60 Bakterienstämmen aus 24 anderen Bakteriengenera wurden auf das Vorhandensein des Gens ompW mittels PCR und DNS-DNS-Hybridisierung untersucht. Das ompW-Gen ließ sich bei allen untersuchten Salmonella-Serovaren nachweisen. Es war bei allen untersuchten Stämmen chromosomal lokalisiert und stets im gleichen Genlokus zwischen den Genen stm1733 und katN organisiert. Immuno-Blot-Analysen mit einem eigens hergestellten OmpW-spezifischen Hyperimmunserum zeigten, dass OmpW in vitro von allen Salmonellen exprimiert wurde, allerdings schwankte das Expressionsniveau etwa um den Faktor zehn. Als einziger Salmonellen-Stamm konnte S. Marina SARC9 als natürliche ompW-Deletionsmutante identifiziert werden, die aufgrund einer 614 bp großen Deletion das OmpW-Protein nicht bilden kann. ompW-homologe Nukleotid-Sequenzen konnten auch in anderen Enterobakterien der Genera Escherichia, Shigella, Citrobacter, Klebsiella und Serratia detektiert werden. Die Hybridisierung der ompW-Gensonde mit chromosomaler DNS von Clostridium sporogenes NCTC532 in Dot-Blot- und Southern-Blot-Analysen deutet erstmals auf eine ompW-homologe Gensequenz bei einem Gram-positiven Bakterium hin. Nur bei den Salmonellen flankierten die Gene stm1733 und katN das ompW-Gen, so dass diese Anordnung nach bisherigen Analysen für Salmonellen spezifisch ist. Die Existenz der natürlichen ompW-Deletionsmutante SARC9 und die erfolgreiche Herstellung der ompW-Knockout-Mutante von Salmonella Typhimurium Stamm SL1344 zeigten, dass das Fehlen von OmpW für Salmonellen kein Letalfaktor ist. Der SL1344-Stamm und seine isogene ompW-Knockout-Mutante sowie die Deletionsmutante SARC9 und vier OmpW-positive S. Marina-Stämme wurden phänotypisch bezüglich ihrer Wachstumseigenschaften charakterisiert, um Hinweise auf die biologische Funktion von OmpW zu erhalten. Eine Bedeutung von OmpW für die Vitalität von S. Tm. konnte bei Anzuchtverfahren in Nährmedien mit hoher Osmolarität, niedrigem pH, limitiertem Eisenangebot oder oxidativem Stress nicht festgestellt werden. Ebenso war weder eine veränderte Sensitivität gegenüber den membrandestabilisierenden Detergentien Triton X-100 und Natrium-Dodecylsulfat noch gegenüber 24 verschiedenen Chemotherapeutika in Abhängigkeit von der OmpW-Expression festzustellen. Insbesondere konnte ein Einfluss von OmpW auf die Sensitivität der Salmonellen gegenüber Ampicillin, Tetrazyklin und Ceftriaxon mittels Agardiffusionstests und Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen im Mikrobouillondilutionstest widerlegt werden, obwohl derartige Eigenschaften für OmpW von S. Typhimurium beziehungsweise für OmpW-homologe Proteine anderer Bakterien vermutet worden waren. Anzuchtversuche mit den isogenen Salmonellen-Stämmen in M9-Ca-Mangelmedien lieferten erstmals Hinweise für einen Einfluss von OmpW auf das Wachstumsverhalten in Kohlenhydratmangelsituationen. Die Supplementierung von 2 % Natriumazetat führte zu einem leicht gesteigerten, der Zusatz von 0,6 % Di-Natrium-Succinat sogar zu einem etwa 40 % stärkeren Wachstum von SL1344 gegenüber seiner ompW-Knockout-Mutante. Hinweise auf eine Bedeutung von OmpW als bakterielles Adhäsin konnten anhand von Zellkulturversuchen nicht gefunden werden, wenngleich eine Funktion bei der Ausbildung von Virulenzeigenschaften für das OmpW-Homolog von Vibrio cholerae vermutet wird. Diese Beobachtungen unterstützen die Hypothese, dass OmpW Eigenschaften eines Porins besitzt und ein Fehlen von OmpW die Bereitstellung und damit die Metabolisierung der sekundären Kohlenstoffquellen Azetat und Succinat beeinträchtigt. OmpW könnte die äußere-Membran-Komponente eines Redoxsystems im Kohlenhydratstoffwechsel von Salmonellen sein. Eine derartige Funktion von OmpW würde auch gut die bei E. coli beobachtete Ausbildung von Proteinkomplexen zwischen OmpW, der Fumaratreduktase und weiteren Proteinen des Kohlenhydratstoffwechsels erklären. Proteins of the outer membrane of Salmonella spp. are promising target structures for diagnostic applications, therapeutic treatment and development of new vaccines. The objective of the present study was to investigate systematically to what extent the outer membrane protein W (OmpW) is present among salmonellae. Furtheron, an isogenic ompW knockout mutant should elucidate the influence of OmpW on the vitality of salmonellae. In particular, we searched for hints about the biological role of OmpW and what influence the loss of OmpW has on the survival and fitness of salmonellae in different environmental conditions. A representative collection of 100 different Salmonella strains representing both species, all subspecies and 19 distinct O-groups as well as 60 other Gram-negative and Gram-positive strains belonging to 24 different bacterial genera were analysed for the presence of the ompW-gene by PCR and DNA-DNA hybridization. The ompW-gene was detected in all but one Salmonella strains independently on their belonging to a serovar. In all examinated Salmonella strains the ompW gene was localized on the chromosome between the genes stm1733 and katN. Immuno-Blot assays with a generated OmpW-specific hyperimmune serum revealed that OmpW was expressed by all ompW positive strains in vitro. However, expression levels differed from strain to strain up to the factor ten. Nucleotid sequencing proved the only ompW negative Salmonella strain, S. Marina strain SARC9, as a natural ompW deletion mutant which carried a 614 bp deletion at the ompW-katN-locus. These results show that OmpW is present among salmonellae independently from the serovar. OmpW homologous sequences were detected also in other enterobacteria like Escherichia, Shigella, Citrobacter, Klebsiella and Serratia. Hybridization of the ompW-probe with chromosomal DNA of Clostridium sporogenes NCTC532 performed as Dot-Blot- and Southern-Blot assays detected for the first time an ompW homologous sequence in Gram-positive bacteria. However, only in salmonellae the ompW gene was flanked by the genes stm1733 and katN. Therefore, this genetic arrangement seems to be unique in salmonellae. The existence of a natural ompW deletion mutant and the successful generation of an ompW knockout mutant of Salmonella Typhimurium strain SL1344 demonstrated that the loss of OmpW is not lethal for salmonellae. The strain SL1344, its isogenic ompW knockout mutant as well as the natural ompW deletion mutant SARC9 and four OmpW expressing S. Marina strains were compared for their growth characteristics in order to elucidate the biological function of OmpW. These experiments revealed that OmpW had no significant effect on growth of Salmonella at high osmolarity, low pH-values, limited iron availability and under oxidative stress. Sensitivity of the strains against the membrane destabilizing detergents Triton X-100 and sodium-dodecylsulfate or against 24 different antibiotics did not change with the absence/presence of ompW. In particular, we vitiated a relationship between the OmpW expression and change in sensitivity of salmonellae against ampicillin, tetracycline and ceftriaxone by agardiffusion assays and by bouillondilution assays. Such a relationship was suspected for OmpW of S. Typhimurium and OmpW homologues of other bacteria, respectively. Furthermore, tissue culture assays could not demonstrate OmpW being a bacterial adhesin or intracellular survival factor which is in contrast to suggestions by other investigators who observed a positive effect of OmpW on the virulence of Vibrio cholerae. However, we observed for the first time that OmpW had an effect on the growth of S. Tm. SL1344 in M9-Ca minimal medium under carbohydrate limited conditions. Thus, supplementation of the medium with of 2 % sodium acetate resulted in a slightly better growth and addition of 0.6 % di-sodium succinate even in an about 40 % increased growth of the SL1344 wildtype strain in comparison to its ompW knockout mutant. These observations support the hypothesis that the OmpW is a porin and that the loss of OmpW constricts the uptake and the metabolism of secondary carbon sources like acetate or succinate. OmpW could be the outer membrane component of a redox system in the carbohydrate metabolism of salmonellae. Such a function of OmpW in Salmonella would correspond to the observation that the OmpW of E. coli associates with fumarate reductase and some other proteins of the carbohydrate metabolism to form protein complexes.