Entwicklung eines quantitativen Keimträgertests zur Prüfung der Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln gegen animale Viren im Lebensmittelbereich

Abstract

Im Bereich der Lebensmittelhygiene sind Prüfmethoden für Desinfektionsmittel gegen Bakterien, Pilze und Bakteriophagen gut etabliert. Vom Tier stammende Viren, die Oberflächen im Bereich der Lebensmittelproduktion kontaminieren können, stellen jedoch ein zusätzliches Hygienerisiko dar. Deshalb war es Ziel dieser Arbeit, eine Methode zur Prüfung der viruziden Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln gegen Pathogene dieser Gruppe zu etablieren. Zur Auswahl eines geeigneten Testvirus wurden verschiedene unbehüllte Virusarten, wie bovines Enterovirus Typ 1 (ECBO (Enteric Cytopathogenic Bovine Orphan) Virus), Reovirus Typ 1, felines Calicivirus (FCV) und bovines Parvovirus (BPV), sowie behüllte Virusarten, wie equines Arteritisvirus (EAV), bovines Herpesvirus Typ 1 (BHV1), Newcastle Disease Virus (NDV) und Vaccinia-Virus, auf ihre Tenazität gegenüber verschiedenen bioziden Substanzen (Formaldehyd, Ameisensäure, Peressigsäure und Natriumhypochlorit) im Suspensionsversuch bei 20°C untersucht. Die Untersuchung erfolgte in Anlehnung an die vom "Comité Européen de Normalisation" herausgegebenen "Richtlinien für die Prüfung chemischer Desinfektionsmittel" (CEN) (ANONYM, 2003a). Weitere Auswahlkriterien umfassten Laborparameter, wie die Vermehrbarkeit der Viren in permanenten Zellkulturen und die Höhen der hierbei erreichten Virustiter, als auch Fragen zur Biologie der Erreger, besonders das Gefährdungsrisiko für Mensch und Tier bei akzidentieller Exposition. Gemessen an allen Kriterien erwies sich das ECBO- Virus als für die Fragestellung geeigneter als die übrigen o.a. Virusarten. Unter Verwendung dieses Virus wurden anschließend diverse Parameter, die zur Etablierung der Prüfmethodik führten, untersucht. Darunter fielen Versuche zum Studium des Einflusses der Trocknung auf den Infektiositätstiter des Virus, der Eignung verschiedener Eiweißlösungen zur Optimierung der Rückgewinnung des ECBO-Virus von den Keimträgeroberflächen, sowie zur Reduzierung von Infektiositätsverlusten bei der Trocknung, als auch Untersuchungen zur Bestimmung der Desorption des ECBO-Virus von den Keimträgeroberflächen. Nach den Ergebnissen dieser Versuche verlor das ECBO- Virus in wässriger Suspension nach der Antrocknung im Glasröhrchen durchschnittlich eine Zehnerpotenz (entspricht 90 %) an Infektiosität. Dieser Verlust konnte durch den Zusatz verschiedener Lösungen aus Hefeextrakt und bovinem Serumalbumin (jeweils 0,1% Endkonzentration in den Prüfansätzen) oder bovinem Serumalbumin allein mit einer Endkonzentration von 0,5% zum Zweck der Simulierung der unter Praxisbedingungen vorliegenden "Verschmutzung" bis ungefähr 0,5 log10 KID50/ml reduziert werden. Die Unterschiede zwischen beiden Eiweißlösungen waren sehr gering. Da die Mischung aus Hefeextrakt und bovinem Serumalbumin eher einer Belastung unter Feldbedingungen entsprach als reines BSA, wurde diese Lösung für alle weiteren Versuche verwendet. Als Varianten für die Keimrückgewinnung von den Trägermaterialien aus Makrolon und V2 A-Stahl dienten ein sogenanntes Abschwemmverfahren sowie auch ein sogenanntes Abstrichverfahren. Zwischen diesen zur Rückgewinnung des Testvirus verwendeten Techniken ergaben sich jedoch keine auf die Eignung einer bestimmten Methode hinweisenden Unterschiede. Von Seiten der Praktikabilität wurde der Abschwemmtechnik mit einer anschließenden Behandlung mit Vortexer und Ultraschall für jeweils 30 s der Vorrang gegeben. Insgesamt lagen die Wiedergewinnungsraten jedoch deutlich unter 10 % und erreichten nur in Einzelfällen einen Wert von maximal 10 %. Die absoluten Titerhöhen waren jedoch ausreichend hoch (in allen Versuchen > 4 log10 KID50/Träger). Somit steht für die Prüfung der Desinfektion von Viren an Flächen ein Modell zur Verfügung, das die für die Beurteilung der Wirksamkeit eines Desinfektionsverfahrens geforderte Reduktion der Virusinfektiosität über vier Zehnerpotenzen ermöglicht. Unter Verwendung dieser Methodik wurden abschließend 4 kommerziell erhältliche Desinfektionsmittel aus der 6. Desinfektionsmittelliste der DVG (Lebensmittelbereich), die die 4 am häufigsten verwendeten Wirkstoffgruppen repräsentieren, auf Viruzidie geprüft. Bei allen 4 untersuchten Präparaten war eine sichere Beurteilung der viruziden Wirksamkeit (Verfolgung der Virusinaktivierung über mindestens 4 Zehnerpotenzen) möglich. Eine viruzide Wirksamkeit war jedoch nur bei dem Präparat auf der Wirkstoffbasis von Natriumhypochlorit (Steril) vorhanden. Die weiteren Desinfektionsmittel mit den Hauptwirkstoffen Alkohol (Divodes FG), Alkylamin (HM 3000) und Quaternäre Ammoniumverbindung (neoquat s) besaßen dagegen keine ausreichende oder gar keine viruzide Wirkung. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass sich die beschriebene Methode durch ihre Praktikabilität, Genauigkeit, Schnelligkeit und Kostenneutralität auszeichnet. Sie kann daher für die Überprüfung der viruziden Wirksamkeit von chemischen Desinfektionsmitteln in der Lebensmittelhygiene empfohlen werden. Protocols for the efficacy testing of disinfectants against bacteria, fungi and phages are well established in food hygiene. Because animal viruses that contaminate surfaces in food processing facilities pose an additional hygienic risk, a germ carrier test was developed to assess the virucidal efficacy of disinfectants against this group of pathogens. A suited test virus was selected based on its low implication for human and animal health, good replication in permanent cell lines, and presumptive tenacity to disinfectants. In preliminary experiments, the work was evaluated by studying the efficiency of different biocidal agents against a variety of non-enveloped viruses [bovine enterovirus type 1 (ECBO (Enteric Cytopathogenic Bovine Orphan) virus), mammalian reovirus type 1, feline calici virus (FCV), and bovine parvovirus (BPV)], as well as enveloped viruses, as equine arteritisvirus (EAV), bovine herpesvirus type 1 (BHV1), Newcastle disease virus (NDV) and vaccinia virus. Respective tests were performed as suspension tests at a temperature of 20°C according to the "Comité Européen de Normalisation" (CEN) for "Guidelines for the Examination of Chemical Disinfectants" (Anonymous, 2003a). Because of its high tenacity, harmlessness and good replication in permanent cells bovine enterovirus virus was favorised as test virus. Afterwards with use of ECBO virus was determined the loss of viral infectivity by air drying and the suitability of different protein solutions for the optimising of the recovery of ECBO virus from the carrier surfaces, and for the reduction loss of viral infectivity by the drying, as well as the investigation to determine recovery rates of ECBO virus from the carrier surfaces. We noticed that the drying of ECBO virus induced a loss of viral infectivity of about 1 log unit (about 90%). Adding proteins as 0,1% yeast extract (YE) plus bovine serum albumin (BSA) each as a final concentration in virus suspension or 0,5% bovine serum albumin (BSA) as a final concentration were shown to reduce the loss of viral infectivity due to the adsorption procedure to a minimum of 0,5 log unit of TCID50. The mixture of BSA plus YE seems to be the most suitable soiling under field condition for virucidal testing than pure BSA, this solution was used for all other tests in this study. Different desorption techniques, like smear and submerge methods were applied in order to regain adsorbed virus from carrier surfaces (Stainless steel and polyethylene), and both techniques revealed comparable results. An optimum was achieved after applying the submerge technique followed by vortexing and ultrasonic treatment for 30 s. The rates of recovered virus ranged below 10% in some caces and in another cases up to 10%. The absolute titre of virus recovered was always more than 104 TCID50/carrier and was sufficient to study the decline of viral infectivity by four order of magnitude, which fullfills the requirement to evaluate the virucidal efficacy. The optimized protocol proved suitable to assess the efficacy of disinfectants. Four representative disinfectants commonly used in the area of food hygiene were selected for this purpose from the 6. List of Disinfectants for Use in Food Hygiene approved by the German Veterinary Association (DVG). In all four examined disinfectants was possible to evaluate the virucidal efficacy (decline of viral infectivity at least by 4 orders of magnitude). Only sodium hypochlorite (steril®) was found to be highly effective while other agent such as alcohol (Divodes FG®), Alcylamin (HM 3000®) and quaternary ammonium compounds (neoquat s®) exhibited no virucidal efficacy in this assay. In conclusion, the method described herein is of good practicability, accuracy, fast acting and economical and can be recommend for screening of the virucidal efficacy of chemical disinfectants in food hygiene.