Untersuchungen zur in vitro Empfindlichkeit gegen Antibiotika und zur molekularen Charakteristik von Borrelia spielmanii im Vergleich zu anderen humanpathogenen Vertretern des Borrelia burgdorferi-Komplexes

Abstract

Die durch Spirochäten der Gattung Borrelia verursachte Lyme Borreliose ist die häufigste und wichtigste von Vektoren übertragene Krankheit der nördlichen Hemisphäre. Neben den Genospezies B. burgdorferi s.s., B. afzelii und B. garinii besitzt dabei auch die neu beschriebene Genospezies B. spielmanii humanpathogenes Potential. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das antibiotische Empfindlichkeitsspektrum von B. spielmanii näher zu charakterisieren, da bisher keine Daten zur Empfänglichkeit dieser Genospezies gegen Antibiotika und Chemotherapeutika vorlagen. Der Empfindlichkeitstestung vorausgehend wurden alle Isolate molekulargenetisch analysiert. Hierzu wurden eine Plasmidprofilanalyse mittels PFGE, eine RFLP-Analyse der 5S-23S Intergenic Spacer DNA sowie eine Sequenzanalyse dieses Genabschnittes durchgeführt. Auf Basis der Sequenzanalyse wurde anschließend ein phylogenetischer Stammbaum der getesteten Isolate erstellt. Wenngleich die zur Differenzierung humanpathogener Genospezies häufig verwendete RFLP-Analyse des 5S-23S Intergenic Spacers keine eindeutige Unterscheidung von B. afzelii und B. spielmanii zuließ, konnten durch eine Kombination der oben genannten Verfahren alle Isolate molekulargenetisch eindeutig charakterisiert und zuverlässig subtypisiert werden. Zur Testung der antibiotischen Empfindlichkeit von B. spielmanii kam eine standardisierte kolorimetrische Mikrodilutionsmethode zur MHK-Bestimmung mit anschließender konventioneller Subkultivierung zur MBK-Bestimmung zum Einsatz. Getestet wurden therapierelevante Antibiotika aus den Klassen der Tetracycline, der beta-Lactame und der Makrolide sowie zwei Substanzen aus der Klasse der Fluorchinolone mit bekanntermaßen schlechter Wirksamkeit gegen Borrelien. Vorausgehende Qualitätskontrollexperimente mit S. aureus dienten der Untersuchung signifikanter Medium-Antibiotika-Interaktionen. Die hier festgestellte Aktivitäts-steigerung der Makrolide sowie der Aktivitätsverlust einiger beta-Lactame in BSK-Medium wurden bei der Interpretation der Resultate berücksichtigt. Es zeigte sich in den Untersuchungen, dass die Wirksamkeit therapierelevanter Antibiotika gegen die getesteten B. spielmanii-Isolate im Wesentlichen der Wirksamkeit dieser Substanzen gegen die übrigen humanpathogenen Borrelien entsprach. Zwar waren die verwendeten B. spielmanii-Isolate statistisch signifikant empfindlicher gegen Erythromycin, Clarithromycin und Doxycyclin und zeigten eine signifikant höhere MBK für Amoxicillin, diese Unterschiede sind jedoch insgesamt als zu gering anzusehen, um für die medizinische Praxis als therapeutisch relevant eingestuft zu werden. Eine generell erniedrigte antibiotische Empfindlichkeit von B. spielmanii ist damit als möglicher Grund für ein Therapieversagen oder die Entstehung persistenter Borrelien-Infektionen weitgehend ausgeschlossen. Die getesteten therapierelevanten Antibiotika zeigten eine gute und zuverlässige bakteriostatische bzw. bakterizide Wirkung gegen alle humanpathogenen Genospezies. Die Heterogenität der Erreger bezogen auf ihre Empfindlichkeit gegen gängige antibiotisch wirksame Substanzen ist folglich auch unter Einbeziehung von B. spielmanii keine Erklärung für die gelegentlich beobachtete Erregerpersistenz oder das Fortbestehen klinischer Symptome der Lyme Borreliose nach adäquater antibiotischer Therapie. Lyme disease is caused by the spirochete B. burgdorferi and today is regarded as the most frequent and most important vector-borne illness in the northern hemisphere. The genospecies B. burgdorferi s. s., B. afzelii and B. garinii have long been known as causative agents of Lyme borreliosis, whereas B. spielmanii has only recently been delineated and described as the fourth human pathogenic species. The objective of this study was to further characterize the antibiotic susceptibility pattern of B. spielmanii, since so far nothing is known about the effects of antibiotic substances against this particular genospecies. First of all, the strains were genotyped applying PFGE for plasmid profile analysis in combination with RFLP analysis and sequencing of the 5S-23S intergenic spacer region. Subsequently, a phylogenetic tree based on the sequences of this region was generated. RFLP analysis of the 5S-23S intergenic spacer has often been used to discriminate human pathogenic borreliae, but couldn t reliably differentiate between B. spielmanii and B. afzelii. Nevertheless, a combination of the methods mentioned above enabled clear and reliable genetic characterization of all isolates. The antibiotic susceptibility pattern of B. spielmanii was investigated using a standardized colorimetric microdilution method followed by conventional subculture. MICs and MBCs of all isolates were determined for 7 antibiotic substances belonging to the groups of tetracyclines, beta-lactams and macrolides as well as for two fluorquinolones with known low activity against borreliae. Quality control experiments with S. aureus for investigation of antibiotic-medium interactions revealed a loss of activity for some beta-lactams as well as enhanced activity of macrolides in BSK-medium. As demonstrated in our study, the efficacy of relevant antibiotic substances against B. spielmanii parallels that against the other currently known human pathogenic species. Statistical analysis revealed indeed significantly higher susceptibility of B. spielmanii for erythromycin, clarithromycin and doxycycline and significantly lower MBCs for amoxicillin compared with other human pathogenic isolates. However, the differences seem too subtle to be of significant clinical relevance. We disapproved the assumption that B. spielmanii is less susceptible against antibiotic substances relevant for the therapy of Lyme borreliosis thus leading to clinical treatment failure or persistent infections. All tested substances except for the quinolones showed good to excellent in vitro activity against B. spielmanii and the other three Borrelia species pathogenic for humans. The heterogeneity of the causative agent of Lyme disease including the recently delineated species B. spielmanii explains neither the persistence of spirochetes nor the development of chronic symptoms after appropriate antimicrobial treatment.