Molekulare Determinanten der Infektiosität von Hepatitis B Virus Partikeln

Abstract

Zu Beginn dieser Arbeit wurden die ersten Marker einer etablierten HBV Infektion in einer suszeptiblen Zellkultur nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass die cccDNA und die mRNA einen Tag nach der Infektion mittels real-time LightCycler PCR (polymerase chain reaction) nachweisbar sind. An Tag 3 nach der Infektion sind die sekretierten Virusantigene, HBsAg und HBeAg, mittels enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) nachweisbar. Behandelt man Hepatozyten mit dem reverse Transkriptase-Inhibitor Lamivudin, so ist die Sekretion von neusynthetisiertem HBV komplett inhibiert, nicht aber die Produktion und Sekretion der Virusproteine HBsAg und HBeAg. Desweiteren konnte der Antikörper HB1 charakterisiert werden. Der Antikörper reagiert im ELISA nur mit HBsAg, nicht aber mit einem analogen Protein eines Nagetier HBV-ähnlichen Virus (WHsAg). Im Western Blot kann man mittels des Antikörper HB1 das SHBs (kleines Hepatitis B Virus Oberflächenprotein), MHBs (mittleres Hepatitis B Virus Oberflächenprotein) und LHBs (großes Hepatitis B Virus Oberflächenprotein) der hier untersuchten Genotypen A2, C und D nachweisen. Mit Hilfe des Antikörpers HB1 konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal eine relative Quantifizierung der Oberflächenproteine von HBV durchgeführt werden. Diese Quantifizierung mit dem LI-COR ODYSSEY® Infrared-Fluoreszenz Imaging System ergab, dass bei Genotyp A2 das LHBs 16 %, das MHBs 15 % und das SHBs 58 % der Gesamtoberflächenproteine ausmachen. Bei Genotyp D sieht die Verteilung ähnlich aus. Das SHBs von HBV ist ein aus 226 Aminosäuren aufgebautes Membranprotein. Die Region der Aminosäuren 99 bis 170 der S-Domäne bildet die HBs-Antigenschleife mit 8 Cysteinen, die inter- und intramolekulare Disulfidbrücken ausbilden können. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass in der HBs-Antigenschleife 4 freie Sulfhydrylgruppen (SH-Gruppen) vorliegen und 4 Sulfhydrylgruppen miteinander verknüpft sind. Durch Infektionsversuche an primären Tupaia belangeri Hepatozyten (PTHs) konnte weiterhin gezeigt werden, dass nach einer Vorbehandlung des HBV mit einer reduzierenden Chemikalie keine Infektion mehr etabliert werden kann. Blockiert man die freien Sulfhydrylgruppen mit Maleimid, so ist die Infektion nur teilweise inhibiert. Das zeigt die Bedeutung der Disulfidbrücken der HBs-Antigenschleife des HBV für den Infektionsvorgang. Versuche mit oxidiertem Glutathion zeigten, dass eine Vorbehandlung des HBV mit einer oxidierenden Chemikalie die Infektion steigert. Eine Vorbehandlung des HBV mit der Protein Disulfid Isomerase (PDI) hatte keinen Einfluß auf die HBV Infektion, mutmaßlich deswegen, weil HBV selbst im HBsAg mit dem CXXC Motiv das aktive Zentrum einer PDI aufweist. Für die Zukunft wäre eine Aufklärung der Disulfidbrücken und ihrer Änderung während des Infektionsvorgangs wünschenswert. Bis heute konnte für das Hepatitis B Virus noch kein Rezeptor und Eintrittsmechanismus in Hepatozyten identifiziert werden. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass HBV an Heparan-Sulfat-Proteoglykane bindet, die als eine Art "low-affinity" Rezeptor im Dissé schen Raum dienen. Anschließend wechselt das HBV mit seiner PräS1 Bindungsseite und der N-terminalen Myristinsäure an den "high-affinity" Rezeptor. Dann erfolgt die Aufnahme von HBV in ein noch nicht bekanntes Kompartiment. Dazu konnte gezeigt werden, dass eine Infektion von HBV weder durch Chlorpromazin noch durch Bafilomycin inhibiert werden kann. Demnach benutzt HBV nicht die Clathrin-abhängige Endozytose für den Eintritt in Hepatozyten und ist auch nicht von einer anschließenden Ansäuerung im Endosom abhängig, um eine Infektion zu etablieren. Versuche mit einem Protein Kinase C Inhibitor zeigten, dass die Protein Kinase C ebenfalls keinen Einfluss auf den Eintrittmechanismus des HBV hat. In the beginning of the work the first markers for a successful HBV infection of a susceptible cell culture should be identified. On day 1 after HBV infection cccDNA and mRNA could be detected by real-time LightCycler PCR. On day 3 after infection the virus-antigens HBsAg and HBeAg were detected by immuno assay. Treatment of hepatocytes with the reverse-transcription inhibitor lamivudine led to inhibition of secretion from newly synthesized HBV, but could not inhibit the secretion of the virus-proteins HBeAg and HBsAg. In addition, the monoclonal antibody HB1 was characterised. In immuno assay studies, HB1 reacted only with HBsAg but not with an analogous protein from a rodent HBV-like virus (WHsAg). In Western blot analysis, HB1 detected the SHBs, MHBs and LHBs of genotypes A2, C and D. With the help of this antibody a relative quantification of the HBV surface proteins could be done for the first time using filament-rich particles. The result of this quantification with the LI-COR ODYSSEY® Infrared-Fluoreszenz Imaging System for genotype A2 was as follows: LHBs contributes 16 %, MHBs 15 %, and SHBs 58 % of the whole surface proteins of HBV. For genotype D the distribution is similar. The SHBs of HBV is a membrane-protein consisting of 226 amino acids. The region from aa 99 - 170 of the S-domain forms the antigenic loop and contains 8 cysteine residues, which can form inter- and intramolecular disulfide-bonds. In the present work, it could be shown for the first time that the antigenic loop has 4 free cysteines and 4 cysteines that are linked via disulfide-bonds. Infection assays with primary Tupaia belangeri hepatocytes showed that a pretreatment of HBV with a reducing agent inhibits HBV infection completely. Blocking of free sulfhydryl-groups leads to an inhibition of HBV infection. This shows the importance of the disulfide-bonds of the antigenic loop from HBV for infection. Pretreatment of HBV with oxidised glutathione could increase the HBV infection. Pretreatment with a protein-disulfide-isomerase had no effect on HBV infection. Conjectural HBV has an own CXXC motiv in the HBsAg itself, in which an active centre is present. For the future a clearing of the disulfide-bridges and their change during the infection-process would be desirable. Until nowadays, no receptor or entry mechanism for HBV could be identified. In the present work it was shown for the first time that HBV binds in the space of Dissé to heparan-sulfate-proteoglycans, which serve as low-affinity receptor. Subsequently HBV moves with its preS1 binding-site and the N-terminal myristic-acid to the yet unknown high-affinity receptor. Then, the HBV is taken up in a yet unknown compartment. Furthermore it could be shown that chlorpromazine and bafilomycin were not able to inhibit HBV infection suggesting that, HBV does not use clathrin-dependent endocytosis with following acidification in the endosome for entry. Moreover, experiments with an protein-kinase C inhibitor showed that the potein-kinase C has no effect on HBV infection.