Regulation of Phosphodiesterases by profibrotic regulators

Abstract

Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a series of events in which fully differentiated epithelial cells undergo transition to a mesenchymal phenotype giving rise to fibroblasts and myofibroblasts. EMT is increasingly recognized as important process not only in development, but also in adult life: in wound healing, fibrosis, and the invasion and metastasis of tumor cells. The phenotypic conversion involves loss of epithelial polarity, loss of epithelial markers, loss of adherens and gap junctions, cytoskeletal reorganization, and transition to a spindle-shaped morphology concomitant with acquisition of mesenchymal markers and an invasive phenotype. Cyclic nucleotide phosphodiesterases (PDE) comprise a family of related proteins, which can be subdivided into 11 families (PDE1-PDE11) based on their amino acid sequences, sensitivity to different activators and inhibitors and their ability to preferentially hydrolyze either cAMP (PDE4, 7, 8) or cGMP (PDE5, 6, 9) or both (PDE1, 2, 3, 10, 11). cAMP and cGMP are ubiquitous second messengers and consequently PDEs propagate many signaling pathways, including proliferation, migration, and differentiation.The present study was undertaken to evaluate the potential role of phosphodiesterases (PDE) in TGF-beta11 induced EMT in the human alveolar epithelial type-II cell line-A549. TGF-beta1 induced EMT was characterized by morphological alterations and by expression changes of EMT specific markers. TGF-beta1 treatment decreased expression of epithelial phenotype markers such as E-cadherin, cytokeratin-18, zona occludens-1 and increased expression of mesenchymal phenotype markers such as collagen I, fibronectin-EDA and alpha;-smooth muscle actin. Interestingly, a 2-fold increase in total cAMP-PDE activity following TGF-beta1 stimulation was found and attributed to increased PDE3 and PDE4 activities. Further mRNA and protein expression demonstrated upregulation of PDE4A and PDE4D isoforms in TGF-beta1 stimulated cells. Most importantly, treatment of TGF- beta1 stimulated epithelial cells with the PDE4 selective inhibitor Rolipram potently inhibited EMT changes in a Smad-independent manner by decreasing reactive oxygen species (ROS). Rolipram pre-treatment resulted in E-Cad restoration as well as in Fibronectin abolishement. In addition, Rho kinase signaling activated by TGF- beta1 during EMT demonstrated as a positive regulator of PDE4. Our findings suggest that TGF-beta mediated up-regulation of PDE4 promotes EMT in alveolar epithelial cells. Thus, targeting PDE4 isoforms may be a novel approach to attenuating EMT-associated lung diseases, such as pulmonary fibrosis and lung cancer. Die Epithelial-Mesenchymale Transition (EMT) voll differenzierter Epithelzellen in Zellen mesenchymalen Phänotyps, wie (Myo) Fibroblasten, spielt nicht nur beim Wachstum und in der Entwicklung eine Rolle, sondern nimmt auch bei Prozessen wie der Wundheilung, der Entstehung von Fibrose und der Invasion und Metastasierung von Tumorzellen einen wichtigen Stellenwert ein. Während der phänotypischen Umwandlung verliert die Zelle, neben ihrer für Epithelzellen typischen Polarität, ihre epithelialen Marker und durchläuft eine Neustrukturierung ihres Zellskeletts. Dies hat eine spindelförmige Morphologie zur Folge und wird von der Aneignung mesenchymaler Marker begleitet.Zyklische Nukleotid Phosphodiesterasen (PDEs) bilden eine Familie verwandter Proteine, die, basierend auf ihren Aminosäuresequenzen, ihrer Sensitivität gegenüber verschiedenen Aktivatoren und Inhibitoren und aufgrund ihrer Fähigkeit entweder cAMP oder cGMP oder beide zyklischen Nukleotide zu hydrolisieren, in 11 Familienmitglieder eingeteilt werden. Sie beeinflussen mehrere zelluläre Signalwege, sowohl durch den Abbau der ubiquitären second messenger cAMP und cGMP, als auch durch direkte Interaktion mit anderen Proteinen ,was Auswirkungen auf Proliferation, Migration und Differenzierung von Zellen hat. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, welche Rolle Phosphodiesterasen in der TGF-beta1 induzierten EMT von humanen, alveolären Typ II-Zellen (A549-Zellen) spielen. Die durch die Stimulation mit TGF-beta1 induzierte EMT wurde anhand morphologischer Veränderungen und durch Genexpressionsanalysen der epithelialen Marker E-Cadherin, Zytokeratin-18, Zona Occludens-1 und der mesenchymalen Marker Kollagen I, Fibronektin-EDA und alpha-Smooth Muscle Aktin überprüft. Interessanterweise zeigte sich nach der TGF-beta1-Stimulation eine 2fach gesteigerte Aktivität der cAMP-hydrolysierenden PDEs, welche auf eine erhöhte Aktivität der PDEs 3 und 4 zurückgeführt werden konnte. Des Weiteren konnte auf Gen und Proteinexpressionsebene gezeigt werden, dass sowohl die PDE4A, als auch die PDE4D in TGF-beta1 stimulierten Zellen erhöht exprimiert werden. Zudem ist von Bedeutung, dass die Behandlung TGF-beta1 stimulierter Zellen mit dem PDE4 spezifischen Inhibitor Rolipram zu einer geringeren Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) führte und es so in Smad unabhängiger Weise zur Epithelial-Mesenchymalen Transition kommen konnte. Zusätzlich zeigte sich, dass der Rho-Kinase-Signalweg, welcher während der EMT durch TGF-beta1 aktiviert wird, einen positiv regulatorischen Effekt auf die PDE4 hat. Zusammenfassend weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass die durch TGF-beta1 verursachte erhöhte Expression der PDE4 die EMT in alveolären Epithelzellen begünstigt. Daher wäre eine speziell auf die PDE4 abzielende Behandlung ein neuer Ansatz um EMT-assozierte Lungenkrankheiten wie Lungenfibrose und Lungenkrebs zu verbessern.