Histopathologische und immunhistologische sowie zytologische und molekularbiologische Untersuchungen zur Pathogenese und Therapie equiner Sarkoide

Abstract

Aus 29 equinen Sarkoiden konnten insgesamt fünf primäre fibroblastenähnliche Zelllinien angelegt werden, die bis zur 20. Passage BPV-1-DNA enthielten. Mittels Southern Blot konnte das BPV-1-Genom in voller Länge von ungefähr 8 kbp nachgewiesen werden. Die virale DNA ließ sich durch ISH in den Zellkernen der kultivierten Tumorzellen lokalisieren. Die Zelllinien zeigten ein für Tumorzellen typisches Wachstum. Alle fünf Zelllinien alterten, bevor sie das Stadium der Permanenz erreichten. Die experimentelle Infektion von Syrischen Goldhamstern mit BPV-1 führte bei 27 von 63 Tieren innerhalb von 13 Monaten zur Ausbildung von Hauttumoren, die makroskopisch und histopathologisch dem equinen Sarkoid glichen. Mittels PCR und ISH war BPV-1-DNA in 9 von 13 untersuchten Tumoren nachweisbar. Es konnten keine Zusammenhänge zwischen Dignität, Größe oder Wachstumsgeschwindigkeit des Tumors und der Anzahl BPV-DNA-positiver Tumorzellen nachgewiesen werden. Die equinen Sarkoidzellen reagierten immunhistologisch hauptsächlich am dermoepidermalen Übergang positiv mit einem Antikörper spezifisch für Vimentin, wohingegen in der Tiefe kaum positive Zellen zu sehen waren. Beim Hamstertumor reagierten ebenfalls nur wenige Tumorzellen positiv für Vimentin. Die positiven Zellen waren sowohl subepithelial als auch in der Tiefe des Tumors zu finden. In vitro zeigten die Sarkoidzellen ein vergleichbares Muster und reagierten nur schwach mit dem Antikörper spezifisch für Vimentin. Eine Zelllinie war vollständig negativ. Mittels PCR und 19 überlappenden Primerpaaren und nachfolgender DNA-Sequenzierung war es möglich, erstmalig an einem equinen Sarkoid zu zeigen, dass das BPV-1-Genom vollständig in equinen Sarkoiden enthalten ist. Die erhaltene Sequenz mit 7942 bp war mit einer bekannten BPV-1-Sequenz zu 98 % identisch. Sequenzabweichung im ORF von E5 stimmten mit der sarkoidspezifischen BPV-1 Sequenz SWISS 1 überein. Weitere als sarkoidspezifisch geltende Mutationen fanden sich in dieser Sequenz nicht. In equinen Sarkoiden war mittels Immunhistologie und RT-PCR eine Expression des Tumorsuppressorproteins PTEN nachweisbar. Es konnte ein PTEN-Genabschnitt von 205 bp Länge sequenziert und mit einer murinen PTEN-Sequenz abgeglichen werden. Die Sequenzen stimmten zu 95 % überein. In equinen Sarkoiden war trotz Expression von PTEN phosphoryliertes AKT darstellbar. Dies und der Nachweis der Proliferationsmarker Ki67 und PCNA belegen eine Funktionsstörung von PTEN in equinen Sarkoiden. Die BPV-1-induzierten Hauttumoren von jeweils drei Hamstern wurden in einer orientierenden Studie topisch mit dem pflanzlichen Sanguinarin-haltigen Präparat XXTerra behandelt. Hierdurch kam es zu einer Koagulationsnekrose des Tumorgewebes. Der Nekroseherd wurde vom noch lebenden Tumorgewebe durch einen Lymphozytenwall abgegrenzt. Bei insgesamt drei Pferden wurde die Therapie equiner Sarkoide mit XXTerra verfolgt. In zwei Fällen handelte es sich um mehrfach rezidivierte Sarkoide nach teils unterschiedlicher Vorbehandlung. Durch die XXTerra -Therapie entwickelte sich bei allen drei Pferden eine Nekrose mit anschließender Abstoßung des Tumorgewebes. Es kam zu einem vollständigen Wundverschluss. Bei einem Pferd rezidivierte der Tumor zwei Monate nach Therapieende. In den anderen zwei Fällen gab es keine Rezidive. Durch Sanguinarin konnte eine dosisabhängige Reduktion der mitochondrialen Dehydrogenaseaktivität bei equinen Zelllinien hervorgerufen werden. Sarkoidzellen reagierten empfindlicher auf die Sanguinarin-Behandlung als normale Fibroblasten. Durch die inaktivierten animalen Pockenviren AIM 3 und AIM 5 wurden eine Proliferationshemmung der Sarkoidzellen und gleichzeitig eine Proliferationssteigerung der normalen Fibroblasten hervorgerufen. Diese Wirkung wurde durch eine Kombination von beiden Viren verstärkt. Obwohl Cis-4-Hydroxy-L-Prolin eine Senkung der mitochondrialen Dehydrogenaseaktivität bewirkt, rief es eine Steigerung der Proliferation equiner Sarkoidzellen hervor. Immodin bewirkte eine Steigerung der mitochondrialen Dehydrogenaseaktivität und der Proliferation.

Five fibroblast-like cell lines were established from 29 equine sarcoids that contained BPV?1?DNA up to the 20th passage. Using Southern blotting it was possible to detect the BPV?1?genome in full length of approximately 8 kbp. By means of ISH, the viral DNA was demonstrated to be localized in the nuclei of the cultured tumour cells. The cell lines showed a growth pattern typical for neoplastic cells. All of the five cell lines became senescent before reaching permanence.

The experimental infection of Syrian goldhamsters with BPV-1 resulted in the development of skin tumours in 27 of 63 animals within 13 months. These tumours resembled macroscopically and histopathologically equine sarcoids. Using PCR and ISH, BPV-1-DNA was detectable in 9 of 13 tested tumours. There was no correlation between biological behaviour, size or proliferation of the tumours and the number of BPV-DNA-positive tumour cells.

Using immunohistochemistry with an antibody specific for vimentin, neoplastic cells in equine sarcoids reacted mainly at the dermeoepidermal junction. In contrast, vimentin positive tumour cells were seen only sporadical in deeper layers. In hamster tumours, only a few neoplastic cells reacted positively for vimentin as well. Positive cells were localized subepithelial and in deeper layers. In vitro sarcoid cells showed a comparable pattern and reacted only weakly with a vimentin antibody. One cell line was completely negative. ule Justus-Liebig-Universität Giessen Jahr4. Using PCR with 19 overlapping primer pairs and subsequent DNA-sequencing, it was possible to demonstrate in one equine sarcoid, for the first time, that the complete BPV?1-genome is present in equine sarcoids. The obtained sequence of 7942 bp was identical with a known BPV-1-sequence to 98 %. Sequence variations in the ORF of E5 corresponded with the sarcoid specific sequence SWISS 1. Further sarcoid specific mutations were not found in the new sequence.

In equine sarcoids the expression of the tumoursuppressor protein PTEN was demonstrable using immunohistochemistry and RT-PCR. 205 nucleotides of the equine PTEN gene were analyzed and were identical with a murine PTEN-sequence to 95 %.

In spite of PTEN expression, phopsphorylated AKT was present in equine sarcoids as well. This and the detection of the proliferation associated antigens Ki67 and PCNA account for an impaired function of PTEN in equine sarcoids.

The BPV-1 induced skin tumours of three hamsters were treated topically with the herbal sanguinarine containing compound XXTerra in an exploratory experiment. Coagulation necrosis of tumour tissue developed. The necrotic tissue was demarcated from the viable tumour tissue by lymphocytes.

The therapy of equine sarcoids in three horses with XXTerra was followed. In two cases, the tumours had recurred several times and were pretreated with different methods. XXTerra therapy induced necrosis of tumour tissue in all three horses followed by a complete wound healing. In one horse the tumour recurred two months after the completion of therapy. There was no relapse in the other two cases.

Sanguinarine caused a dose-dependent reduction of the mitchochondrial dehydrogenase activity in equine cell lines. Sarcoid cells reacted more sensitive to the Sanguinarine treatment than normal fibroblasts.

The inactivated animal poxviruses AIM 3 and AIM 5 inhibited proliferation of sarcoid cells and caused increased proliferation in normal fibroblasts at the same time. A combination of both viruses potentiated the effects. Even though Cis-4-Hydroxy-Prolin caused a reduction of mitochondrial dehydrogenase activity, administration resulted in increased proliferation. Immodin caused an increase of mitochondrial dehydrogenase activity and cellular proliferation.