Chlorose in Synechococcus elongatus PCC 7942 : Untersuchung des Response Regulators NblR und des Transkriptionsfaktors NtcA

Abstract

In dem nicht-diazotrophen Cyanobakterium S. elongatus führt ein Mangel an gebundenem Stickstoff oder Schwefel zu einem Differenzierungsprozess der Chlorose. In diesem streng regulierten Prozess wirken die Reaktionen der generellen Stressantwort, das nbl-System, sowie die Nährstoff spezifischen Reaktionen, des NtcA Regulons. In dieser Arbeit konnte durch SPR Bindungsstudien von NtcA spezifische NtcA-abhängige Promotoren von unspezifischer DNA aufgrund der Affinität und Kinetik der Bindungseigenschaften von NtcA unterschieden werden. Die Bindung von NtcA an die DNA ist abhängig vom NtcA-Bindemotiv und den umgebenden Sequenzen. Durch Transkriptom Daten konnte die erste experimentelle Analyse des gesamten NtcA -Regulons in einem Cyanobakterium erstellt werden. Bereits unter Ammonium-wachstumsbedingungen traten Unterschiede im Transkriptom zwischen Wildtyp und NtcA-Mutante auf. Im Stickstoffmangel waren in der NtcA Mutante all die Gene nicht induziert, die für Proteine kodieren, die an der Aufnahme (z.B. amtB, amt1) und Metabolisierung von Stickstoffverbindungen (z.B. nirA, nirB, glnA, glnN) beteiligt sind. Zusätzlich zu den bereits bekannten NtcA-abhängigen Genen konnten 20 weitere, bisher nicht beschriebene NtcA-abhängig induzierte Gene entdeckt werden. Für die im Wildtyp nach Stickstoffmangel am höchsten induzierten Gene nsi5, merR, 2150, 2149 und 2148, die als polycistronische mRNA transkribiert werden, konnte ein NtcA-Bindemotiv funktionell nachgewiesen werden. Nach Stickstoffentzug kam es in der NtcA-Mutante zur Hyperrepression der Gene die für Proteine des PS I und PS II, der Bestandteile der Phycobilisomen (apc, cpc), der ATP Synthase sowie für Proteine des Elektronentransport in der Photosynthese Cytochrom, Plastocyanin und für Proteine des NDH-1L-Komplexes kodieren. Da diese Gene keine NtcA-Bindemotive enthalten, handelt es sich vermutlich um sekundäre Folgen der ntcA Mutation. In der PipX-Mutante waren die Transkripte aller NtcA-abhängig induzierten Gene im Vergleich zum Wt deutlich erniedrigt. Dies bestätigt die Annahme, dass PipX für die volle Aktivierung von NtcA benötigt wird. Die durch NtcA reprimierten Gene waren hingegen in der PipX Mutante nicht beeinträchtigt. In einer NblR-defizienten Mutante ist der gesamte Prozess der Chlorose gestört. Neben dem fehlenden Abbau der Phycobilisomen (PBS), bedingt durch die ausbleibende NblA Bildung, konnte in den ersten Stunden nach Stickstoffentzug noch eine Neusynthese von Phycobiliproteinen nachgewiesen werden, deren Synthese im Wt sofort nach Stickstoffentzug gestoppt wurde. Alle in der NblR-Mutante nicht induzierten Gene waren in der NtcA Mutante ebenfalls nicht induziert. Die durch NtcA reprimierten Gene waren hingegen in der NblR Mutante nicht beeinträchtigt. Die Gene, die für Proteine des NDH-1L Komplexes kodieren, der an der Respiration und dem zyklischen Elektronentransport um PS I beteiligt ist, sowie die Gene, die für Proteine des PS I und PS II kodieren, wurden in der NblR-Mutante im Stickstoffmangel sehr stark reprimiert. Zusätzlich wurden die Transkripte der Proteine der ATP Synthase in der NblR Mutante nach Stickstoffentzug drastisch reprimiert. Die NblR-Mutante stirbt innerhalb von 24 bis 48 h nach Stickstoffentzug ab. Mit dem Verlust der Elektronentransportrate und photosynthetischen Aktivität sowie der ATP-Generation verliert die NblR Mutante die notwendige Energie um ein Überleben im Stickstoffmangel zu ermöglichen und eine Regeneration der Zellen nach Stickstoffgabe einzuleiten. Neben nblA konnte mit nsi5 ein weiteres in der NblR-Mutante fehlreguliertes Gen identifiziert werden, dass im Wildtyp spezifisch im Stickstoffmangel induziert wird. Eine direkte DNA-Bindung von NblR konnte jedoch weder an den nblA- noch an den nsi5 Promotor nachgewiesen werden. Möglicherweise interagiert NblR mit anderen DNA-gebundenen Komponenten der Transkriptions-Maschinerie.