Analytik von Aminosäuren und biogenen Aminen in fermentierten Lebensmitteln mittels HPLC und GC

Abstract

Aminosäuren stellen die monomeren Bausteine der für lebende Organismen wichtigsten Stoffklassen, der Peptide und Proteine, dar. Besondere Bedeutunghaben [Alpha]-Aminosäuren, bei denen Amino- und Carboxylgruppe gemeinsam am C-2 gebunden sind. Beim Abbau von Proteinen werden regelmäßig 20verschiedene [Alpha]-AS gefunden, die dementsprechend als proteinogene AS bezeichnet werden. Proteinogene Aminosäuren (AS), mit Ausnahme desGlycins, besitzen zumindest ein Chiralitätszentrum, welches durch ein asymmetrisch substituiertes C-Atom gebildet wird, so daß zu jeder dieser AS einzueinander spiegelbildlicher Enantiomer existiert. Im Verlauf der Evolution hat sich in der Biosphäre eine starke Dominanz der Synthe-se und Verwendung von L-Aminosäuren (L-AS) gegenüber vonD-Aminosäuren (D-AS)herausgebildet. Trotz der weitgehenden Etablierung stereoselektiver Prozesse in der belebten Natur zeigt sich innerhalb derproteinogenen AS eine beachtenswerte Verbreitung der D-AS. Die Entwicklung und Anwendung neuer Analysenmethoden zur Trennung von D- und L-ASzeigt jedoch, daß D-AS im Menschen, in Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen (MO) und Antibiotika, sowie in Lebensmitteln häufiger vorkommen als bislangangenommen wurde. Von Bakterien ist schon seit längerer Zeit bekannt, daß sie einen ausgeprägten D-AS-Stoffwechsel besitzen, der sie zur Biosynthese der D-AS aus den L-ASdurch entsprechende Racemasen und Epimerasen befähigt. D-AS sind in fermentierten LM durch zur Herstellung eingesetzten MO weit verbreitet. Durch dasEinwirken mikrobieller Enzyme werden L-AS teilweise in ihre optischen Antipoden umgewandelt. Zusätzlich werden durch Autolyse von Bakterien D-AS ausderen Peptidoglycan freigesetzt, so daß D-AS als mikrobielle Stoffwechselprodukte in diesen Lebensmitteln (LM) in relativ hohen Mengen auftreten. Vieleprotein- und aminosäurehaltige LM werden bei ihrer Herstellung, technologischen Bearbeitung oder Zubereitung einer Behandlung mit Säuren, Laugen undHitze unterzogen, was zu einer mehr oder weniger starken Epimerisierung führt, die durch Gegenwart von Metallionen zusätzlich katalysiert werden kann. Aus diesem Grunde wurde von BRÜCKNER et al. vorgeschlagen, daß D-AS als Indikatoren für die mikrobielle Fermentation und weiterhin zur Qualitäts- undAuthentizitätskontrolle für fermentierten LM verwendet werden können. Biogene Amine (BA), stickstoffhaltige, basische Verbindungen, entstehen imStoffwechsel von Tieren, Pflanzen oder MO. Da ihre Bildung in LM größtenteils aus AS durch Aktivität der Decarboxylasen in MO erfolgt, sind besondershohe Amingehalte in LM zu erwarten, bei deren Herstellung bzw. Verarbeitung oder Lagerung biochemische oder besonders mikrobiologischeEiweißveränderungnen wie Fermentation oder Verderb stattfinden. Insbesondere in LM, die einer mikrobiellen Fermentation unterzogen wurden odermikrobiell verdorben sind, können höhere Konzentrationen an BA gefunden werden. Aus diesem Grunde wird die Menge an Aminen zur Beurteilung dermikrobiellen Belastung von LM vorgeschlagen. In der vorliegenden Arbeit wurden Aminosäuren und biogene Amine in asiatisch fermentierten Lebensmitteln(engl. Oriental or Asian Fermented Food ) exemplarisch anhand einer Gruppe fermentierter Sojaprodukte u. a. Sojasaucen, Miso und Pepperonipasten,sowie Sake und Fischsaucen mittels HPLC und teilweise GC unter-sucht, um neue Perspektiven zur Qualitäts- und Authentizitätskontrolle für die untersuchtenLebensmitteln zu ermitteln. Zur achiralen AS-Analyse wurde eine HPLC-Methode nach Vorsäulenderivatisierung mit o-Phthaldialdehyd/3-Mercaptopropionsäure (OPA/MPA) mitKombination von 9-Fluorenylmethyloxycarbonylchlorid (FMOC-Cl) verwendet. Die Gesamtgehalte an freien AS in fermentierten Sojasaucen lagen zwischen15 g/l und 57 g/l sowie zwischen 75 g/l und 396 g/l in gemischten Sojasaucen. Besonders auffällig war bei dieser Untersuchung die Detektion dernichtproteinogenen AS Cit und Orn, welche in Rohmaterialien (Sojabohnen) nicht vorhanden und durch Umwandlung von Arg während der Fermentationentstanden waren. Alle fermentierten Sojasaucen zeigten eine positive Korrelation zwischen der Reifungsdauer und dem relativen Anteil von Orn. Somit könnendiese beiden nichtproteinogenen AS als Indikatoren zur Qualität- und Authentizitätskontrolle für Sojasaucen verwendet werden. Aufgrund der Ähnlichkeit des Herstellungsverfahrens wiesen alle untersuchten Miso- und Pepperonipastenproben ein den fermentierten Sojasaucen ähnlichenAS-Muster auf. Orn wurde in allen, Cit in den meisten der untersuchten Misoproben detektiert. Sojabohnenmiso wiesen aufgrund der langen Reifungsdauereinen hohen Anteil von Orn und Cit im Vergleich zu Weizenmiso auf. Bei dieser Untersuchung wurde festgestellt, daß das Verhältnis zwischen den Anteilen vonArg und Orn als ein Kriterium für die Bestimmung der Fermentationsdauer dienen könnten. Zur Trennung und Bestimmung von freien D-AS wurde eine chirale HPLC-Methode nach Vorsäulenderivatisierung mit o-Phthaldialdehyd und N-Isobutyryl-L(bzw. D)-cystein (OPA/IBL(D)C) verwendet. Außerdem wurde die Anwendbarkeit der OPA/IBL(D)C-Methode für verschiedene HPLC-Apparaturen zurenantioselektiven Aminosäurenanalytik am Beispiel von LaChrom® - und HP 1090-System überprüft. In allen untersuchten fermentierten Sojaproduktenwurden erhebliche Mengen an D-AS gefunden. Dabei wurde festgestellt, daß besonders D-Asp und D-Ala als Marker für Fermentation dienen könnten. Infermentierten Sojasaucen war D-Ala aufgrund der Aktivität der mikrobiellen Ala-Racemase dominierend. In gemischten Sojasaucen war D-Asp aufgrund derSäurehydrolysierung der Rohmaterialien Major-D-AS. Im Falle der Misountersuchung konnte D-Ala für die Bestimmung der Fermentationsdauer festgestelltwerden. Aufgrund der unterschiedlichen Reifungsdauer war D-Ala in Reispepperonipasten sowie D-Asp in Weizenpepperonipasten dominierend. Sake undFischsaucen wiesen eine hohe Gehalte an D-Asp, D-Glu, D-Ser, D-Pro und D-Ala auf. Biogene Amine wurden als Ergänzung zur Qualitätskontrolle für fermentierte Lebensmittel unter Einsatz einer HPLC-Methode nach Vorsäulenderivatisierungmit para-Nitrobenzyloxycarbonylchlorid (PNZ-Cl) analysiert. Die Gesamtgehalte an BA lagen zwischen 79 mg/l und 1215 mg/l in Sojasaucen sowie zwischen75 mg/kg und 1085 mg/kg in Miso. Pepperonipasten wiesen bedingt durch den verlangsamten Fermentationsverlauf einen niedrigen BA-Gehalt auf. In Sakekonnten Pea und Oct in allen sowie Spd und Spm in einer Probe detektiert werden. Die OPA/IBL(D)C-Methode ermöglicht die Trennung aller proteinogenen L-AS und der entsprechenden D-Enantiomere (17 DL-AS Paare), Glycin, Gaba,DL-Cit, DL-Orn sowie des internen Standards L-Abu mit Ausnahme von Prolin und Cyst(e)in mittels System HP 1090 an einer konventioneller RP-18-Phase(Hypersil®ODS2) unter Verwendung eines einfachen linearen Gradienten innerhalb von 75 min in einem chromatographischen Lauf. Der Wechsel von IBLCauf IBDC führt dabei zu einer Elutionsumkehr innerhalb der Enantiomerenpaare, bei Derivatisierung mit IBLC eluieren zuerst die L-AS, bei IBDC die D-AS.Die Reihenfolge der AS untereinander bleibt jedoch unverändert, was vorteilhaft für die Identifizierung und Absicherung der Zuordnung der detektierten Signaleist. Die Gesamttrennung und die Elutionsfolge der AS waren beim LaChrom®System und beim HP 1090 System nahezu identisch, wobei einigeÜberschneidungen bzw. Koelutionen einzelner AS beobachtet wurden.