Untersuchungen zum Wachstumsverhalten des humanen U87-Glioblastoms in der immundefizienten Nacktmaus Balb/c nu/nu unter multiantiangiogener Therapie und ionisierender Bestrahlung

Abstract

Die Aktivierung der Angiogenese, also die Induktion des Gefäßwachstums aus bereits bestehenden Blutgefäßen, ist eine essentielle Voraussetzung für das Wachsen und die Metastasierung von Tumorgewebe. In diesen komplexen Vorgang hemmend bis hin zur Tumorkontrolle bzw. -rückbildung einzugreifen ist das Ziel der Antiangiogeneseforschung. Durch eine Vielzahl von an unterschiedlichen Ansätzen wirkenden Angiogenesehemmern wird es möglich, verschiedene dieser Inhibitoren therapeutisch kombiniert einzusetzen und dadurch deren hemmenden Effekt auf das Tumorwachstum noch zu steigern.Strahlentherapie als wirksamste nichtchirurgische Tumortherapie kann zur Kuration oder zur Tumorwachstumsverzögerung führen, kann aber im exponierten Tumorgewebe als Folge eines Tumor Escape Mechanismus auch eine Verstärkung der Angiogenese sowie eine Radioresistenz hervorrrufen. Diese mit Hilfe von gleichzeitigen Gaben von Angiogeneseinhibitoren zu unterbrechen scheint ein sinnvoller therapeutischer Ansatz zu sein.Die in dieser Arbeit verwendeten Angiogeneseinhibitoren SU6668, SU5416, S247 und Celecoxib (Celebrex®) wurden sowohl als Monotherapien als auch in kombinierten Therapieschemata mit und ohne Radiotherapie am Beispiel des U87-MG-Xenograft-Tumormodells des humanen Glioblastoms in vier verschiedenen Versuchsreihen untersucht.Die Inokulation der in-vitro angezüchteten Tumorzellen erfolgte dabei subkutan an der Hintergliedmaße von BALB/c nu/nu-Nacktmäusen. Nach erfolgreichem Anwachsen der Tumoren begann die Therapie mit den unterschiedlichen Angiogeneseinhibitoren sowie die lokale fraktionierte Bestrahlung mittels einer 60Cobalt-Strahlenquelle. Die Tumormessung erfolgte in regelmäßigen Abständen mittels des Kalipers. Histologische sowie immunhistologische Untersuchungen erfolgten zu definierten Zeitpunkten.Die erste Fragestellung dieser Arbeit beschäftigte sich mit den beiden indirekten Angiogeneseinhibitoren SU6668 und SU5416, die in Kombination als auch als Monotherapie mit und ohne Strahlentherapie auf ihren Effekt auf das Tumorwachstum des humanen Glioblastoms hin untersucht werden sollten. Tatsächlich konnte in dieser Versuchsreihe eine deutlich gesteigerte Tumorwachstumsverzögerung durch die Kombination sowohl mit als auch ohne Radiotherapie im Vergleich zu den jeweiligen Monotherapien ermittelt werden. Eine weitere Untersuchung verglich die Monotherapien mit den kombinierten Therapieansätzen des kleinmolekularen & #945;v& #946;3-Antagonisten S247 und dem selektiven COX-2-Inhibitor Celecoxib. Beide Substanzen zeigten in ihrer kombinierten Anwendung im Vergleich zu den Einzeltherapien einen gesteigerten Effekt auf die Tumorwachstumshemmung. Ihre Kombination mit der Radiotherapie ergab ebenfalls eine gesteigerte Wirkung. Das Tumorwachstum war durch die Medikamente deutlich verzögert. Interessante Ergebnisse lieferte die dritte Versuchsreihe dieser Arbeit, in der alle vier Angiogeneseinhibitoren in einem multiantiangiogenen Cocktail verabreicht wurden. Die Tumorwachstumsverzögerung dieser Versuchsgruppe fiel deutlich gesteigert aus und zeigte sich im gleichen Therapieansatz kombiniert mit der Radiotherapie als besonders stark ausgeprägt. Das Tumorwachstum kam jedoch auch hier nicht völlig zum Stillstand. Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe scheinen hinsichtlich des Tumorwachstums am humanen U87-MG-Tumormodell eine vielversprechende Kombination zu sein. Die Versuchstiere litten jedoch hochgradig an Nebenwirkungen und mussten noch vor Ende des eigentlichen Beobachtungszeitraumes euthanasiert werden.Die histologischen sowie immunhistochemischen Untersuchungen der einzelnen Versuchsreihen standen grundsätzlich in Einklang mit den Ergebnissen der Wachstumsverzögerung.In einer letzten Fragestellung wurden die Angiogeneseinhibitoren SU5416 undSU6668 kombiniert und einzeln an bereits sehr fortgeschrittenen Tumoren des humanen U87-Glioblastoms angewandt und verglichen. Es zeigte sich, dass zwar eine signifikante Tumorwachstumshemmung sowohl bei der Einzel- als auch bei der bimodalen Therapie auftrat; signifikante Unterschiede in den Gruppen konnten jedoch im Falle der bereits fortgeschrittenen Tumoren nicht ermittelt werden.Zusammenfassend lässt sich den Ergebnissen dieser Arbeit zufolge feststellen, dass der kombinierte Einsatz von Angiogeneseinhibitoren sowohl mit als auch ohne Radiotherapie einen zumindest additiven Effekt auf die Angiogeneseinhibition bzw. die damit zusammenhängende Tumorwachstumshemmung zeigt und somit kombinierte Therapieschemata aussichtsreiche Strategien für zukünftige Krebstherapiekonzepte darstellen.In Hinblick auf tiermedizinische Behandlungen ist aufgrund der derzeit nur bedingten Therapieerfolge in der Humanmedizin sowie aufgrund der hohen Beteiligung der Tierhalter an den Therapiekosten nicht davon auszugehen, dass sich Antiangiogenese hier bald als ernstzunehmende Ergänzung zu den bislang üblichen Methoden etabliert. Grundsätzlich jedoch ist langfristig, auch vor dem Hintergrund der an sich preiswerten Herstellungskosten der kleinmolekularen chemischen Hemmstoffe eine antiangiogene Therapie auch in der Tiermedizin möglich. The activation of angiogenesis, or rather the induction of vascular growth from existing blood vessels, is an essential prerequisite for the growth and dissemination of tumor tissue. Anti-angiogenesis research is aimed at inhibiting this complex process to the point of tumor control or even degeneration. Through a variety of anti-angiogenic compounds used in different approaches, it becomes possible to combine these inhibitors and apply them therapeutically in order to increase the inhibiting effect on the tumor growth even more.Radiation therapy has been considered the most effective non-surgical tumor therapy and can lead to recovery or inhibit growth of the tumor, but it can also evoke a Tumor Escape Mechanism in the exposed tumor tissue, consequently amplifying angiogenesis as well as resistance to the radiation. It seems to be a more sensible therapeutic approach to interrupt this by simultaneously administering angiogenesis inhibitors.The angiogenesis inhibitors used in this work - SU6668, SU5416, S247 and Celecoxib (Celebrex®) were examined both as a monotherapy and in a combined therapy scheme both with and without radiation therapy using the example of the U87-MG-Xenograft tumor models of the human glioblastoma in four different series of experiments.The inoculation of the in-vitro tumor cells was carried out subcutanously on the lower extremitiy of BALB/c nu/nu nude mice. After the tumors had successfully grown, the therapy began with various angiogenesis inhibitors as well as the locally fractionated irradiation by means of a 60Cobalt radiation source. The tumor was measured at regular intervals using a caliper. Histological and immunhistochemical examinations were conducted at set times.The first question of this work focuses on the indirect angiogenesis inhibitors SU6668 and SU5416, which were to be examined both in combination and as a monotherapy with and without radiation therapy with regards to their effect on the growth of the tumor of the human glioblastoma. In fact, in this series of experiments the growth of the tumor was distinctly slowed in the combination of inhibitors both with and also without radiation therapy as opposed to the respective monotherapies. A further experiment compared the monotherapies with the combined therapy approaches of the small molecular αvβ3 antagonist S247 and the selective COX-2-Inhibitor Celecoxib. Both substances show an enhanced ability for blocking the tumor growth when combined rather than in the singular therapies. Their combination with the radiation therapy also yielded an increased effect. The growth of the tumor was significantly delayed by the medications. Interesting results were yielded by the third series of experiments in this work, in which all four angiogenesis inhibitors were administered in a multiangiogenic cocktail. The tumor growth blockage in this test group was significantly enhanced and proved to be even more highly pronounced when the same therapy approach was combined with the radiation therapy. However, the tumor growth also did not come to a complete halt here. The results of this series of experiments appear to be a promising combination with regards to the tumor growth on the human U87-MG tumor model. However, the laboratory animals suffered profoundly from side effects and had to be put to sleep before the end of the observation period. The histological and immunhistochemical experiments in each of the series of experiments were fundamentally led to a delay in the growth of the tumor.In a final test the angiogenesis inhibitors SU5416 and SU6668 were combined and applied individually to tumors that were already advanced in the human U87 glioblastoma and then compared. While this showed that the tumor growth was significantly inhibited both in the singular as well as in the bimodal therapy, significant distinctions among the groups could not be found in the case of the already advanced tumors.Overall, the results of this work show that the combined application of angiogenesis inhibitors both with and without radiation therapy proves to have at least an additive effect on the angiogenesis inhibition and the corresponding delay in tumor growth, and, thus, combined therapy schemes constitute promising strategies for future concepts in cancer therapy.With regards to veterinary care one cannot assume that antiangiogenesis will soon be a serious supplement to the current methods, due to the current limited therapeutic success in human medicine as well as the high costs for the pet owners. However, in a long term view the use of antiangiogenesic therapy in veterinary medicine could principally be possible, especially when considering the inexpensive production costs for small molecular chemical inhibitors.