Morphologische Charakterisierung und ex vivo Funktionsuntersuchungen zum Einfluss des cholinergen Systems auf den ziliären Transport im Eileiter der Maus

Abstract

Der Einfluss des cholinergen Systems auf die ziliäre Aktivität ist bereits an zilientragenden Epithelien der Trachea bzw. der Lunge eingehend untersucht worden. Im Gegensatz dazu ist nichts über eine regulatorische Funktion des cholinergen Systems auf die Zilien des Eileiterepithels bekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, einen Einfluss des cholinergen Systems auf die Zilienaktivität des Eileiters, besonders im Hinblick auf mögliche Auswirkungen auf den tubaren Transport, zu untersuchen. Da bis heute keine hoch selektiven Agonisten bzw. Antagonisten für die cholinergen Rezeptoren (mAChR und nAChR) bekannt sind, haben wir unsere funktionellen Studien an Muskarinrezeptor-Knockout-Mäusen der Untereinheiten M1, M3, M4 und M5 sowie an deren korrespondierenden C57Bl6 Wildtyp-Mäusen (verpaart und unverpaart) durchgeführt. Insgesamt wurden 107 Wildtyp- und 5 M1-/-, 4 M3-/-, 4 M4-/- sowie 5 M5-/- Mäuse untersucht. Die Funktionalität der Zilien wurde anhand eines neu etablierten digitalen videomikroskopischen Systems durch Messung der Partikeltransportgeschwindigkeit (PTG) sowie der Zilienschlagfrequenz (ZSF) unter Verwendung der Pharmaka ATP, Serotonin, Muskarinchlorid, Atropinsulfat und ACh untersucht. Der Vorteil des videomikroskopischen Analysesystems liegt in der Aufrechterhaltung des natürlichen Gewebeverbandes, so dass die Versuche unter Bedingungen durchgeführt werden konnten, die denen in vivo stark ähneln. Vergleichend zu der ziliären Aktivität im Eileiter wurden die PTG und die ZSF von Tracheaproben bestimmt. Korrelierend zu den funktionellen Untersuchungen wurden histomorphologische und rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen in Abhängigkeit vom Zyklusstand und einer frühen Trächtigkeit durchgeführt. Der Eileiter der Maus weist segmentabhängig deutliche morphologische Unterschiede auf. So kann die Ampulla anhand der dominanten Anzahl an zilientragende Zellen, Longitudinalfalten und einer weniger stark ausgeprägten glatten Muskulatur leicht vom Isthmus, der durch eine sehr geringe Anzahl an zilientragenden Zellen, Querfalten und eine stark ausgeprägte glatte Muskulatur gekennzeichnet ist, unterschieden werden. Veränderungen der epithelialen Zusammensetzung und der sekretorischen Aktivität sind in Abhängigkeit des Zyklusstadiums bzw. einer frühen Trächtigkeit sehr gering. Die Anzahl zilientragender Zellen in der Ampulla ist während des Zyklus konstant und verringert sich signifikant an den ersten beiden Trächtigkeitstagen. Im Isthmus ist diese zyklusabhängig, mit einer erhöhten Anzahl im Östrus, jedoch trächtigkeitsunabhängig. Der Eileiter befindet sich, im Gegensatz zu dem der Haussäugetiere, zu keinem Zeitpunkt (Zyklus oder Trächtigkeit) in einer Ruhephase. Neutrale und saure Mukopolysaccharide können in allen Zyklusstadien und Trächtigkeitstagen nachgewiesen werden. Im Proöstrus wird nur eine geringe Menge an Mukopolysacchariden synthetisiert. Im Östrus wird im Bereich des Isthmus die höchste Menge an sauren Mukopolysacchariden nachgewiesen, im Metöstrus die geringste. Metöstrus, Diöstrus, Tag 1 und Tag 2 einer Trächtigkeit sind durch ein erhöhtes Auftreten von Stiftchenzellen in der Ampulla und durch stets apikal sowie intrazytoplasmatisch PAS- und Alcianblau-positives Material gekennzeichnet. Entsprechend der geringgradigen Veränderungen der Zellmorphologie während des Zyklus und der frühen Trächtigkeit kann in der Ampulla eine zyklus- und trächtigkeitsunabhängige sehr hohe basale PTG bestimmt werden, wohingegen im isoliertem Isthmus kein Partikeltransport stattfindet. Weiterhin besteht kein Unterschied zwischen den PTG von Wildtyp- und Muskarinrezeptor-Knockout-Mäusen. Dies deutet darauf hin, dass die basale ziliäre Aktivität des Eileiters der Maus weder hormonell noch durch das cholinerge System reguliert wird. Eine Veränderung der Zilienaktivität wird sowohl bei den Wildtyp- als auch bei den Muskarinrezeptor-Knockout-Mäusen ausschließlich durch die Zugabe von ATP erreicht. Dies spiegelt sich in einer geringen Senkung der PTG bzw. der ZSF wider. Da weder eine Veränderung der Zilienaktivität durch eine Gendefizienz bzw. durch die Zugabe von Agonisten bzw. Antagonisten des cholinergen Systems hervorgerufen werden kann, besitzt das cholinerge System keinen Einfluss auf die Zilienfunktion im Eileiter der Maus. Ein Vergleich der ziliären Aktivität von Eileiter und Trachea zeigt, dass die Zilien im Eileiter im Gegensatz zu denen der Trachea kontinuierlich auf einem hohen Niveau schlagen und nicht weiter stimuliert werden können. Im Gegensatz dazu können Zilien der Trachea ihre Schlagfrequenz unter ATP-Einfluss so erhöhen, dass diese der basalen ZSF im Eileiter entspricht und dadurch die basale PTG des Eileiters erreichen. Mit Hilfe der in dieser Arbeit vorgenommenen strukturellen und funktionellen Charakterisierung des Eileiters der Maus konnte gezeigt werden, dass die PTG und die ZSF auf zyklus- und trächtigkeitsunabhängig hohem Niveau verbleiben und somit eine effektive mukoziliäre Clearance des Eileiters gewährleisten. Im Hinblick auf den Gameten- und Embryonentransport spielt die ziliäre Aktivität gegenüber den Kontraktionen der glatten Muskulatur jedoch lediglich eine untergeordnete Rolle. The influence of the cholinergic system on ciliary activity has extensively been studied in the ciliated cells of the trachea and the lung. Contrary the role of the cholinergic system on ciliary activity of the oviductal epithelium is unknown. Therefore, the aim of our study was to analyse the influence of the cholinergic system on ciliary activity and tubal transport. As highly selective cholinergic receptor (mAChR and nAChR) agonists and antagonists do not exist we utilized muscarinic receptor knockout mice (M1-/-, M3-/-, M4-/- and M5-/-) as well as the corresponding C57Bl6 wildtype mice (pregnant and non pregnant). In total, a number of 107 C57Bl6 mice and 5 M1-/-, 4 M3-/-, 4 M4-/- and 5 M5-/- mice were investigated. Functional analyses of ciliary activity were performed measuring PTS (particle transport speed) and CBF (ciliary beat frequency) using drugs such as ATP, 5-hydroxytryptamine, muscarine chloride, atropine sulphate and Ach. For these studies, a newly established digital videomicroscopic analysis system was used, which allows to investigate PTS and CBF near in vivo conditions. Furthermore, ciliary activity of the oviduct was compared to that of the trachea. Additionally, histomorphological and scanning electron microscopic studies at all cyclic stages and the early days of pregnancy were performed and the results were correlated to the results of the functional experiments. Our studies revealed that the mouse oviduct shows distinct morphological differences depending on the segment. The ampulla is characterized by a dominant number of ciliated cells, longitudinal folds and few layers of smooth muscle cells. Contrary the isthmus shows only a few ciliated cells, circular folds and a distinct thick smooth muscle layer. Merely small changes of the epithelial composition and secretory activity occur during the different cyclic stages and the first two days of pregnancy. While the number of ciliated cells in the ampulla is constant during all cyclic stages, there is a significant decrease in the number of ciliated cells in the course of the first 2 days of pregnancy. Contrary in the isthmus the number of ciliated cells depends on the cyclic stage with the highest number occurring at oestrus. However, during pregnancy the number of ciliated cells stays constant. Contrary to other domestic species the mouse oviduct is never in a state of rest. Neutral and acidic mucopolysaccharides are detected during all cyclic stages and during the first days of pregnancy. At prooestrus the lowest amount of mucopolysaccharides is synthesized. The highest abundance of acidic mucopolysaccharides is detected in the isthmus at oestrus, while the lowest one is at metoestrus. Metoestrus, dioestrus as well as day 1 and 2 of pregnancy are characterized by the incidence of slim and emptied secretory cells in the ampulla as well as by PAS- and alcianblue-positive material located in the intracytoplasmatic and apical region. According to the few morphological changes during the cycle and in the course of early pregnancy the basal PTS is maintained at a high level in the ampulla, independent of cyclic stage or early pregnancy. Contrary there nearly is no particle transport in the isolated isthmus. Furthermore, there is no difference of the basal PTS between the wildtype- and muscarinic receptor knockout mice pointing to the fact that the basal ciliary activity in the mouse oviduct is regulated neither hormonally nor by the non-neuronal cholinergic system. Ciliary activity of wildtype- and muscarinic receptor knockout-mice is only altered by ATP, which leads to a decrease of PTS and ZSF. These results show that neither a gene deficiency nor the addition of agonist and antagonists of the cholinergic system influences ciliary beating, which implies that the cholinergic system does not regulate ciliary activity in the mouse oviduct. The comparison of the ciliary activity of the oviduct (ampulla) and the trachea demonstrates that the beating of oviductal cilia is maintained at a high level and can not be further stimulated by addition of ATP. Contrary tracheal cilia beat at a low level but can be stimulated by ATP up to the basal beating level of the oviductal cilia. The structural and functional characterization of the mouse oviduct demonstrate that the PTS and the CBF are maintained on a high level independent on cyclic stage or an early pregnancy thus providing an effective mucociliary clearance of the oviduct. With regard to the transport of gametes and embryos the ciliary activity plays a less important role as compared to smooth muscle contraction.