Modulation dendritischer Zellen als Therapieansatz zur Beeinflussung der akuten und chronischen Abstoßung in einem heterotopen Rattenherztransplantationsmodell

Abstract

Während die akute Abstoßung durch potente Immunsuppressiva weitestgehend beherrscht wird, stellt die chronische Abstoßung, die sogenannte Transplantatvaskulopathie (TVP), einen limitierenden Faktor für das Langzeitüberleben nach Herztransplantation dar und ist noch immer Hauptursache für Morbidität und Mortalität herztransplantierter Patienten. Das Ziel der Transplantationsmedizin besteht darin, diese Langzeitfolgen zu verhindern. Die Versuche der vorliegenden Studie wurden an einem vollständig allogenen heterotopen Ratten-Herztransplantationsmodell vorgenommen, das in ein und demselben Tiermodell sowohl die Untersuchung der akuten Abstoßung als auch der chronischen Abstoßung zulässt. Ohne immunsuppressive Therapie erfolgt die Abstoßung der Transplantate innerhalb von 7 Tagen (n=5). Im zeitlichen Verlauf der akuten Abstoßung kommt es zu einer starken zellulären Infiltration der Transplantate mit mononukleären Zellen, die durch immunhistologische Untersuchungen (Tag 1, Tag 3, Tag 6 und Tag 15) dargestellt werden können. Im chronischen Modell findet man unter CSA-Immunsuppression eine ausgeprägte TVP. In der vorliegenden Studie wurde eine neue Strategie insbesondere im Hinblick auf deren Effekt auf die chronische Abstoßung, die sich als TVP äußert, untersucht. Im Mittelpunkt der Untersuchung stand die Manipulation dendritischer Zellen (DC). Zum einen wurde der Effekt einer Zelltherapie mit manipulierten dendritischen Empfängerzellen und apoptotischen Spenderzellen untersucht. Mittels Zelltherapie wurde versucht, unter minimaler Immunsuppression eine vaskuläre Toleranz zu erzeugen und auf diesem Weg neben der Reduktion der TVP auch die aus der dauerhaften Applikation der immunsuppressiven Pharmaka resultierenden Nebenwirkungen zu minimieren. Zum anderen wurde der Effekt des neuen immunmodulierenden Pharmakons Sanglifehrin A (SFA), welches Schlüsselfunktionen dendritscher Zellen blockiert, getestet. Als Referenzsubstanz diente Cyclosporin A (CSA), dessen Effekte als Vergleich dienten.Bei der Zelltherapie hatte die Vorbehandlung des Transplantatempfängers mit Spendermilzzellen (apoptotisch, nekrotisch) einen verlängernden Effekt auf das Überleben der Transplantate, jedoch ließ sich durch alleinige Zelltherapie kein Langzeittransplantatüberleben bis zum Endpunkt der Beobachtung an Tag 100 erreichen. Unter basaler Immunsuppression (CSA 1,25 mg/kg KGW) zeigte die Zelltherapie mit manipulierten Empfänger-DC keinen die TVP reduzierenden Effekt, während die Vorbehandlung der Transplantatempfänger mit apoptotischen Spendermilzzellen, welche in situ von DC des Transplantatempfängers phagozytiert werden, eine signifikante Reduktion der TVP bewirkte.Die Ergebnisse der Untersuchung der Effekte der neuen Substanz SFA zeigten, dass die akute Abstoßung mit SFA allein nicht beherrscht wird. Das mediane Überleben der Transplantate betrug bei SFA-Monotherapie 9,5 Tage. Die Kombination von SFA mit subtherapeutischer CSA-Immunsuppression (0,625 mg/kg KGW) verlängerte hingegegen signifikant das Transplantatüberleben (p<0,05). Auf diese Weise erreichten 66% der Transplantatempfänger den Endpunkt des Beobachtungs-zeitraums von 100 Tagen (Langzeittransplantatüberleben). Die mediane Überlebenszeit wurde von 24 Tagen bei der Monotherapie mit CSA 0,625 mg/kg KGW auf eine mediane Überlebenszeit von mindestens 100 Tagen bei der Kombinationstherapie erhöht. Immunhistologische Untersuchungen zeigten in der Spätphase der akuten Abstoßung (Tag 6 und besonders Tag 15) eine signifikante Reduktion der zellulären Infiltration der Transplantate mit MHC-II-positiven Zellen wie Monozyten, Makrophagen und T-Zellen bei der Kombinationstherapie (CSA 0,625 mg/kg KGW und SFA) im Vergleich zur alleinigen CSA-Immunsuppression (CSA 0,625 mg/kg KGW). Die wichtigste Beobachtung in der pharmakologischen Studie war eine signifikante Reduktion der TVP bei der Kombination einer therapeutischen Dosis von CSA (1,25 mg/kg KGW) mit SFA im Vergleich zur Monotherapie mit CSA (1,25 mg/kg KGW). In beiden Versuchsreihen zeigte sich, dass die unterschiedlichen Strategien einen protektiven Effekt auf die Gefäße des Transplantates haben, welches sich in einer geringer ausgeprägten TVP äußert. Die Kombinationstherapie von therapeutischen Dosen von CSA mit SFA bewirkte noch eine geringfügig stärkere Reduktion der TVP als die Vorbehandlung der Transplantatempfänger mit apoptotischen Spendermilzzellen. While acute rejection no longer causes significant problems for transplant recipients due to potent immunosuppressive drugs, chronic rejection still remains a major reason for morbidity and mortality in the long term outcome after heart transplantation. For this reason research is presently focused on new immunomodulatory strategies to prevent transplant vasculopathy (TVP).A fully allogeneic heterotopic rat heart transplantation model was used to investigate both acute and chronic rejection. Without immunomodulatory therapy grafts were rejected within 7 days (n=5). Grafts were infiltrated with mononuclear cells such as T-cells, monocytes and macrophages during the period of time of acute allograft rejection. In the chronic model, TVP developed despite immunosuppressive therapy with Cyclosporin A (CSA).The present study evaluated a new therapeutic strategy to specifically target TVP by manipulating dendritic cells. One approach concentrated on the induction of a vascular tolerance induced by the pre-treatment of the recipient with either manipulated dendritic cells or apoptotic donor splenocytes using baseline immunosuppression with CSA. The other approach was the investigation of a new immunomodulatory drug called Sanglifehrin A (SFA), believed to block key functions of dendritic cells. Considering the effects of cell therapy, a prolongation of median survival time in the acute transplantation model, using donor splenocytes (apoptotic, necrotic) was found. Without immunosuppression, however, no induction of long term survival of the transplants could be obtained. Under baseline CSA-immunosuppression (1,25 mg/kg bodyweight) manipulated DC did not affect the development of TVP. Pre-treatment of transplant recipients with apoptotic donor splenocytes significantly reduced TVP. The results of the investigation of the new immunomodulatory drug showed that SFA alone can not prevent acute rejection. Grafts were rejected within 9,5 days. The combination of subtherapeutical CSA-immunosuppression (0,625 mg/kg bodyweight, median survival time: 24 days) with SFA allows 66% of the grafts to reach long term survival (median survival time >100 days, n=6). Immunohistological staining revealed significant differences in cellular infiltration with MHC-II-positive cells on day 6, and particularily on day 15, after transplantation. The combination of subtherapeutical (0,625 mg/kg bodyweight) CSA-immunosuppression and SFA showed a significant reduction of T-cells, monocytes and macrophages compared to subtherapeutical (0,625 mg/kg bodyweight) CSA-immunosuppression alone.The chronic model revealed that the combination of CSA-immunosuppression (1,25 mg/kg bodyweight) with SFA resulted in a significant reduction of TVP compared to monotherapy with CSA (1,25 mg/kg bodyweight). The results of both therapeutical approaches show that both strategies have a protective effect on graft blood vessels. The combination of CSA (1,25 mg/kg bodyweight) and SFA is slightly more effective reducing TVP than pre-treatment with apoptotic donor splenocytes.