Identifizierung der für die Bindung an den zellulären, bovinen Rezeptor CD46 verantwortlichen Sequenzbereiche innerhalb des Glykoproteins E2 von BVDV (NADL)

Abstract

In vorausgegangenen Studien konnte mit Hilfe von NADL/ Alfort E2-Chimären die für die CD46bov-Bindung minimal benötigte Sequenz innerhalb des NADL E2 auf die Aminosäuren 57-293 eingeengt werden. Darauf basierend wurde im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss dieser Aminosäuren auf die Rezeptorbindung näher untersucht, um die für die E2-CD46bov-Interaktion benötigte Sequenz weiter einschränken zu können. Die Ergebnisse sind im Folgenden dargestellt:1. Es wurden 24 NADL/ Alfort E2-Chimären hergestellt und deren Bindung an CD46bov im Zelladsorptionstest getestet. Dabei konnten im NADL E2 vier Peptidsequenzen (Y55LQRCTRET63, H179NcI182, E245gvAiVPQgTLK256 und Q265vIaMdTK272) identifiziert werden, deren Austausch gegen die analogen Aminosäuren des Alfort E2 zu einem Verlust der Bindung an CD46bov führte. Die Insertion dieser vier potentiellen Bestandteile der Rezeptorbindungsdomäne in das Alfort E2 vermittelte jedoch keine Interaktion mit CD46bov.2. Die Etablierung eines Zell-ELISAs ermöglichte die Quantifizierung der Bindung zwischen CD46bov und den chimären E2 Proteinen unter Berücksichtigung der E2-Expression. Dazu wurde das lösliche Fusionspeptid CD46bov-Fchum hergestellt, angereichert und aufgereinigt sowie dessen Menge bestimmt. Die Bindungsspezifität des Proteins wurde mittels konfokaler Mikroskopie, in Infektionsstudien und im ELISA überprüft. 3. Der Zell-ELISA ermöglichte die Identifikation vier weiterer Peptidsequenzen, deren Austausch zu einer Abnahme der CD46bov-Bindungsaktivität unter 35% führte. Es wäre denkbar, dass eine oder mehrere dieser Aminosäureabschnitte an der Bildung der CD46bov-Bindungsdomäne mitbeteiligt sind. Eine Steigerung der CD46bov-Bindungsaktivität konnte beobachtet werden, nachdem die beiden zwischen NADL und Alfort E2 nicht konservierten Cysteine ausgetauscht wurden. Hingegen hatte die Insertion zweier zusätzlicher potentieller N-Glykosylierungsstellen keine bzw. eine mäßige Reduktion der Rezeptorbindung zur Folge. 4. Die Peptidsequenzen Y55LQRCTRET63, H179NcI182, E245gvAiVPQgTLK256 und Q265vIaMdTK272 konnten auf die für die CD46bov-Bindung essentiellen Aminosäuren Q57RCTRET63, H179N180, A248iVPQgTL255 und I267aM269 eingegrenzt werden. Beim Sequenzvergleich dieser Abschnitte mit den analogen Aminosäuren verschiedener BVDV und KSPV-Stämme wurden vorwiegend Ladungsunterschiede festgestellt, welche vermutlich für das unterschiedliche Bindungsverhalten von KSPV und BVDV E2 an CD46bov verantwortlich sind. In previous studies, constructs that express chimeric E2, namely NADL/ Alfort, were employed to determine that the minimal sequence of the NADL E2 protein to interact with the bovine CD46bov comprises the amino acids 57-293. Based on these studies, the influence of these residues on the binding to the receptor was characterized in more detail, to further narrow the sequence required for the E2-CD46bov interaction. The following results were achieved:1. 24 NADL/ Alfort E2-chimeras were generated and their binding activity to CD46bov was tested in a cell adsorption assay. Here four peptidic sequences were identified (Y55LQRCTRET63, H179NcI182, E245gvAiVPQgTLK256 und Q265vIaMdTK272), that when exchanged against the analogue amino acids of the Alfort E2 lead to a loss of binding to CD46bov. The insertion of these four potential components of the receptor binding domains in the Alfort E2, however, were not sufficient to mediate interaction with CD46bov. 2. The optimization of a Cell-ELISA enabled to quantitatively assess the interaction between CD46bov and the E2-chimeras considering the E2-expression in each case. Therefore the soluble fusion protein CD46bov-Fchum was generated and purified. The binding specificity of the protein was verified by laser scanning confocal microscopy, infection studies and ELISA.3. The Cell-ELISA allowed the identification of four additional peptides, that when exchanged lead to a reduction of the binding activity to CD46bov below 35%. It might be that one or more of these peptides are part of the binding domain to CD46bov. An increase in the binding activity to CD46bov could be observed when the two cysteine residues were exchanged that are conserved between NADL and Alfort. On the contrary, the insertion of the two additional potentially N-glycosylation sites caused no or a slight reduction in the receptor binding.4. The peptide sequences Y55LQRCTRET63, H179NcI182, E245gvAiVPQgTLK256 and Q265vIaMdTK272 were modified individually, to identify the essential fragment for the binding to CD46bov. The peptides Q57RCTRET63, H179N180, A248iVPQgTL255 and I267aM269, were the minimal sequence needed from each respective fragment. When the sequence of these fragments were compared with the analogue amino acids from different BVDV and CSFV-strains, mainly charge differences were observed, which are very likely responsible for the different binding of CSFV and BVDV E2 to CD46bov.