Role of NO-cGMP signalling pathway in mediation of ischemia-reperfusion lung injury

Abstract

Ischemia reperfusion (I/R) lung injury is a complex pathological process, which occurs in many clinical situations. Previous studies reported equivocal results about the role of nitric oxide (NO) synthase isoforms in the mediation of the injury and their possible mechanisms of action. Therefore, the aim of our study was to evaluate the role of NO synthase isoforms and NO-cGMP signaling pathway on I/R injury of the lung in an isolated perfused organ model employing rabbits as well as wild type and iNOS and eNOS knock out (KO) mice. Lung injury was assessed by measurements of weight gain and microvascular permeability (capillary filtration coefficient (Kfc)). Release of reactive oxygen species (ROS) into the perfusate was measured during early reperfusion by electron spin resonance (ESR) spectroscopy. Unselective NOS inhibitor (L NMMA), selective iNOS inhibitor (1400W, BYK 191023), selective nNOS inhibitor (VNIO), sGC stimulator (BAY 41-2272), or NADPH oxidase inhibitor (apocynin) were applied 5 min before ischemia according to the protocol. In untreated lungs dramatic rise in Kfc values and weight gain during reperfusion were observed. This was associated with increased reactive oxygen species (ROS) production. In rabbit and wild type mouse lungs, unselective NOS and selective iNOS or nNOS inhibition protected against I/R injury and was accompanied by reduced intravascular ROS release. iNOS and nNOS were upregulated on protein and transcript level in the course of I/R. In eNOS and iNOS KO mice the contribution of nNOS and iNOS to I/R injury was confirmed. Direct stimulation of sGC using BAY 41-2272 significantly attenuated vascular leakage and suppressed ROS release. In an additional set of experiments BAY 41-2272 diminished phorbol-myristrate-acetate (PMA) induced ROS production by NADPH-oxidases. Involvement of ROS generated by NADPH-oxidases in I/R was demonstrated by favorable effects of enzyme inhibition by apocynin. Thus, we conclude that iNOS and nNOS contribute to mediation of I/R induced lung injury by ROS production. On the other hand, NO-cGMP signalling pathway protects against I/R induced lung injury by interfering with NAPDH oxidase activation. Der Ischämie/Reperfusionsschaden (I/R) der Lunge ist ein komplexer pathologischer Prozess, der im Laufe verschiedener klinischer Situationen, wie Organtransplantation und Thrombendarterektomie, auftreten kann. Vorangegangen Studien zeigten unterschiedliche Ergebnisse bezüglich der Rolle von NO Synthase-Isoformen bei der Vermittlung dieser Art des Lungenschadens. Ziel unserer Studie war es, den Einfluss von NO Synthase-Isoformen und des NO-cGMP Signaltransduktionsweges auf den I/R Schaden im Modell der isoliert perfundierten und ventilierten Lungen zu untersuchen.Die Lungenschädigung wurde mittels Gewichtzunahme- und mikrovaskulärer Permeabilitätsmessungen (Kfc) quantifiziert. Die Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wurde in rezirkulierendem Puffer mit Beginn der Reperfusion mittels Elektronenspinresonanz (ESR)-Technik gemessen. Pharmakologische Interventionen wurden mit einem unselektivem NOS Inhibitor (L NMMA), einem selektivem iNOS Inhibitor (1400W, BYK 191023), einem selektivem nNOS Inhibitor (VNIO), einem sGC Stimulator (BAY 41-2272) oder einem NADPH Oxidasen Inhibitor (Apocynin), welche vor Beginn der Ischämie Phase verabreicht wurden, durchgeführt.In unbehandelten Lungen konnte ein drastischer Anstieg des Kfc-Wertes, eine Gewichtzunahme und eine gesteigerte ROS Produktion nach der Reperfusion beobachtet werden. Sowohl in Kaninchen- als auch in wild-type Mauslungen schützte die unselektive NOS-, oder selektive iNOS- und die nNOS-Hemmung vor einem I/R Lungenschaden. Dieser Effekt war mit einer reduzierten intravaskulären ROS Freisetzung verbunden. Zudem konnte eine erhöhte Protein- und mRNA-Menge der iNOS und nNOS Isoformen während I/R beobachtet werden. In iNOS und eNOS defizienten Mäusen wurde die Beteiligung der nNOS und iNOS Isoformen am I/R induzierten Lungenschaden bestätigt. Eine direkte sGC-Stimulierung mit BAY 41-2272 reduzierte den vaskulären Schaden und hemmte die ROS Freisetzung. In zusätzlichen Experimenten verminderte BAY 41-2272 die Phorbol-Myristat-Azetat (PMA)-induzierte ROS Produktion durch NADPH Oxidasen. Eine Beteiligung der von NADPH Oxidasen produzierten ROS an der Entwicklung eines I/R Lungenschadens konnte durch eine Inhibierung dieser Schädigung und Sauerstoffradikalproduktion mittels Apocynin demonstriert werden.Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass sowohl iNOS als auch nNOS über eine ROS-Produktion an der Entwicklung eines I/R Lungenschadens beteiligt sind. Dagegen zeigt eine direkte Stimulation des NO-cGMP-Signaltransduktionsweges eine protektive Wirkung im Hinblick auf eine Reduzierung des I/R Lungenschadens durch eine Beeinflussung der NADPH-Oxidase Aktivität.