Genexpressionsanalyse zur Ausprägung der Lockerbeerigkeit der Weinrebe (Vitis vinifera L.) cv. Spätburgunder

Abstract

Die in dieser Arbeit bearbeitete Fragestellung war ein Teilaspekt des Verbundprojektes Untersuchung zur Existenz und zum Ausmaß genetischer Variation traditioneller Rebsorten im Hinblick auf die Erhaltung genetischer Ressourcen. Alte, traditionelle Rebsorten haben auch im modernen Weinbau eine große Bedeutung. Der Schutz und die Erhaltung sowie die Erforschung dieser breiten genetischen Variation zwischen und innerhalb der Sorten ist ein wichtiger Beitrag zur Nutzung der rebengenetischen Ressourcen.Die genetische Variation innerhalb der Rebsorten ist aus Kleinmutationen und Anpassungsprozessen entstanden. Sehr verschiedenartige Spielarten, klonale Formen oder gar eigenständige Sorten entwickelten sich durch diese Prozesse. Viele Spielarten von Rebsorten weisen nur minimale Unterschiede auf, sind daher phänotypisch oft schwer als diese zu erkennen und lassen sich nur sehr schwierig innerhalb einer Rebsorte abgrenzen. Die Zahl unterschiedlicher Genotypen innerhalb einer Sorte kann sehr groß sein und somit ist die Untersuchung von relevanten Merkmalen, die Wichtiges von Unwichtigem und Einzigartiges von der breiten Masse abzugrenzen helfen, dringend erforderlich.Das Ziel des Projektes war die Identifizierung von Kandidatengenen, die während der Entwicklung der Trauben zwischen kompakten und lockerbeerigen Klonen differentiell exprimiert sind und somit eine lockere Struktur des Traubengerüstes bewirken können. Hierfür wurden an relevantem Pflanzenmaterial, Infloreszenzen und Traubengerüsten in verschiedenen Entwicklungsstadien Genexpressions-analysen mittels molekularer Profilingtechniken durchgeführt. Um interessante Kandidatengene zu identifizieren, wurden zunächst ein kompakter und ein lockerbeeriger Spätburgunder´- Klon mittels Microarray - Hybridisierungen auf differentielle Genexpression hin analysiert. Insgesamt konnten ca. 4000 Gene detektiert werden, die in verschiedenen Entwicklungsstadien differenziell exprimiert zwischen den beiden Klonen waren. Von diesen wurden 20 Kandidatengene für die weiteren Analysen ausgesucht. Neben den Kandidatengenen aus den Ergebnissen der Microarray - Hybridisierungen wurden Gene aus Literaturstudien ausgewählt, die in anderen Pflanzen (z.B. Arabidopsis), bekanntermaßen Merkmalen ähnlich der Lockerbeerigkeit steuern, getroffen. Anschließend wurde die Sequenz der identifizierten Kandidatengene mit den 57662 Contigs der französisch-italienischen Vitis Genomsequenz verglichen (Jaillon et al. 2007), um mögliche Homologien zu finden. Der große Vorteil hierbei besteht darin, dass es sich bei der sequenzierten Rebsorte um einen weitgehend homozygoten Spätburgunder´- Klon (PN40024) handelt. Konnten Homologien in der Vitis Sequenz festgestellt werden, wurden Oligonukleotide für die qRT PCR entwickelt. Auf diese Weise konnten 14 interessante Gene gefunden werden. Insgesamt wurden 34 Kandidatengene auf differentielle Expression hin untersucht. Die sechs Kandidatengene bZiP, REVOLUTA, LATERAL SUPPRESSOR, ERECTA, SUPERSHOOT und SHOOT MERISTEMLESS zeigten zu mindestens einem Entwicklungszeitpunkt differentielle Unterschiede in der Genexpression zwischen den kompakten Klonen und den lockerbeerigen Klonen. Diese Expressionsunterschiede waren stabil über beide Versuchsjahre hinweg und es konnte kein Unterschied zwischen zwei Standorten gefunden werden.Für diese sechs Kandidatengene wurde der mögliche Promotorbereich in silico bestimmt, mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert. Bei den vier Kandidatengenen bZiP, ERECTA, SUPERSHOOT und SHOOT MERISTEMLESS konnten Single Nucleotide Polymorphism (SNP) in den Sequenzen der Promotorbereiche zwischen den kompakten und den lockerbeerigen Klonen detektiert werden. Einige dieser SNPs differenzierten eindeutig zwischen kompakt und locker. Auf Basis dieser Sequenzunterschiede wurden molekulare Marker entwickelt, die momentan auf ihre Funktionalität überprüft werden.Prinzipiell war es möglich sowohl mit der Microarray Technologie als auch mit quantitativer Real Time PCR Expressionsunterschiede zwischen zwei Rebklonen erfassen zu können. Die in dieser Arbeit identifizierten Kandidatengene bZiP, ERECTA, SUPERSHOOT und SHOOT MERISTEMLESS könnten interessante Marker für das Merkmal Lockerbeerigkeit sein. Aufgrund der Sequenzunterschiede konnten molekulare Marker entwickelt werden, die nach Prüfung auf Funktionalität, für die Klonenselektion oder für die Rebenzüchtung eingesetzt werden können. Dadurch könnten gezielt lockerbeerige Klone identifiziert werden, die für die Rebenzüchtungen eingesetzt werden könnten. The question worked on in this project was an aspect of the joint research project Investigation to the existence and to the magnitude of genetic variation of traditional grapes in the view of the preservation of genetic resources. Old, traditional grapes also have in the modern wine-growing a great importance. The protection and the preservation as well as the investigation of this wide genetic variation between and intra the cultivars is an important contribution to the use of the genetic resources. The genetic variation intra a cultivar has originated from small mutations and adaptation processes. Very various variants, clonally forms or even independent cultivars developed by these processes. Many variants of grape cultivars show only minimum differences, hence, they are often hard to be recognised phenotypical as this and can be separated only very difficultly intra a cultivar. The number of different genotypes intra a cultivar can be very big. Therefore investigation of the relevant signs which help to separate important from insignificant and unique of the wide mass urgently necessarily.The aim of the project was the identification of candidate genes which are differentially expressed between the compact and the loose clones during the development of the clusters. Therefore genetic expression analyses were carried out in relevant plant material, inflorescences and fruit sets in different development stages by the use of profiling techniques. To identify interesting candidate genes, a compact and a loose Pinot noir´ clone were analysed to differentially expression by the use of microarray hybridisation. All together approx. 4000 genes could be detected, which were in different development stages differentially expressed between both clones. For further investigations 20 candidate genes were selected. Beside the candidate genes from the results of the microarray hybridisations genes, which control traits similarly of the looseness of the cluster in other plants (e.g. Arabidopsis), were selected from literature studies. Afterwards the sequences of the identified candidate genes was compared to the 57662 Contigs of homozygous Pinot noir´ clone PN40024 genome sequence (Jaillon et al. In 2007) to find possible homology. If homology could be ascertained in the vitis sequence, oligonucleotides were developed for qRT PCR. In this way 14 interesting genes could be found. All together 34 candidate genes were examined on differentially expression by qRT PCR. Six candidate genes bZiP, REVOLUTA, LATERAL SUPPRESSOR, ERECTA, SUPERSHOOT and SHOOT MERISTEMLESS showed at least to one development stage differentially differences in the genetic expression between the compact and the loose clones. These expression differences were stable over the two test years and no difference could be found between two locations. For these six candidate genes the supposed promoter region was determined in silico, amplified by PCR and afterwards the sequences were analysed. In the sequences of the promoter regions of the four candidate genes bZiP, ERECTA, SUPERSHOOT and SHOOT MERISTEMLESS "single Nucleotide Polymorphism" (SNP) could be detected between the compact and the loose clones. Some of these SNPs differentiated unambiguously between compactly and laxly. On the basis of these sequence differences molecular markers were developed. At the moment they are checked for their functionality. In principle it was possible to find expression differences between two clones with both technologies. The candidate genes identified in this work, bZiP, ERECTA, SUPERSHOOT and SHOOT MERISTEMLESS could be interesting markers for the trait looseness of the cluster. On account of the sequence differences molecular markers could be developed. After check on functionality, they could be used for identify laxly clones and marker selected grape breeding.