Untersuchungen zu Assoziationen von Mikrosatelliten und Kandidatengenen mit der Scrapieempfänglichkeit beim Schaf

Abstract

Das Ziel der Arbeit bestand darin, Mikrosatelliten auf Schafchromosomen 14 und 15 sowie funktionelle und positionelle Kandidatengene beim Schaf auf eine Assoziation mit der Empfänglichkeit für klassische und atypische Scrapie hin zu überprüfen.Hierzu wurden 102 klassisch scrapiepositive Tiere und 71 atypisch scrapiepositive Tiere, die in den Jahren 2002 - 2005 in Deutschland als scrapiepositiv identifiziert worden waren, untersucht. Als Kontrolle dienten 441 scrapienegative oder unverdächtige Herdenmitglieder.Die Mikrosatelliten MCM 159, MCMA53, UWCA5, CSAP26E, CSRD63, BM6507, MCMA16, BMS2812 und RM004 wurden in drei Multiplex-PCRs amplifiziert und anschließend elektrophoretisch aufgetrennt. Die Allelfrequenzen wurden für scrapiepositive und Kontrolltiere nach Scrapietyp getrennt ermittelt und untereinander verglichen. Hierbei ergaben die Mikrosatelliten MCMA53 und MCMA16 hoch signifikante bzw. signifikante Unterschiede in den Allelfrequenzen zwischen atypisch scrapiepositiven Tieren und Kontrolltieren. In den von klassischer Scrapie betroffenen Herden unterschieden sich die Allelfrequenzen des Mikrosatelliten MCM159 deutlich zwischen positiven und Kontrolltieren. Diese Ergebnisse können auf Gene in der Nähe der genannten Mikrosatelliten hindeuten, die die Scrapieempfänglichkeit beim Schaf beeinflussen.Im ovinen Cathepsin B konnte in der Sequenzanalyse eine Nukleotidsubstitution (C>T) an Position 391 des neunten Introns nachgewiesen werden. Durch PCR-RFLP-Analyse mit dem Enzym LweI konnten die Allele identifiziert werden. Zwischen scrapiepositiven Tieren und Kontrolltieren wurden weder in den Genotypfrequenzen noch in den Allelfrequenzen signifikante Unterschiede festgestellt.An Position 12 des neunten Exons des ovinen Cathepsin D wurde eine stille Mutation (C>T) detektiert. Bei Vorliegen des Wildtypallels (C) wurde an dieser Stelle durch das Programm ESEfinder 3.0 ein potentieller Exon Splicing Enhancer (ESE) identifiziert. Dieser konnte bei dem mutierten Allel (T) nicht mehr detektiert werden. Die scrapiepositiven Tiere und Kontrolltiere wurden an Position 12 des neunten Exons mit Hilfe eines PCR-RFLP durch das Enzym BseYI typisiert. Es konnten jedoch weder bei den atypisch noch bei den klassisch scrapiepositiven Tieren im Vergleich zu den Kontrolltieren signifikante Unterschiede in den Genotyp- oder Allelfrequenzen festgestellt werden.Beim ovinen Calpain, Large Polypeptide L2 wurde der Promotorbereich und ein Teil des ersten Exons untersucht. Über die gesamte Länge der Sequenz wurde eine CpG-Insel mit zwei G/C-Boxen identifiziert. Die in der Sequenz vorliegenden Motive lassen auf eine fehlende Methylierung schließen und sprechen für eine Zugehörigkeit des Calpain, Large Polypeptide L2 zu der Familie der Housekeeping Gene. An der 191. Position vor Beginn des ersten Exons wurde im Promotorbereich eine Nukleotidsubstitution (G>T) detektiert. Bei Vorliegen des Wildtypallels (G) wurde durch das Programm MatInspector eine potentielle Bindungsstelle für den Transkriptionsrepressor Zinc Finger Protein Insulinoma-associated 1 (IA-1) festgestellt, welche bei dem mutierten Allel (T) nicht vorlag. Scrapiepositive Tiere und Kontrolltiere wurden durch eine ASPCR typisiert und zweifelhafte Ergebnisse wurden mit Hilfe einer nested PCR mit sich anschließendem RFLP durch das Enzym MvaI abgesichert. Zwischen positiven und Kontrolltieren konnten bei keinem Scrapietyp signifikante Unterschiede in Genotyp- oder Allelfrequenzen festgestellt werden.Im Kallikrein 1-Gen wurde an Position 392 des vierten Introns eine Nukleotidsubstitution (C>T) detektiert. Zum Nachweis der Mutation wurde ein PCR-RFLP mit dem Enzym BsmFI durchgeführt. Weder bei den klassisch scrapiepositiven Tieren noch bei den atypisch scrapiepositiven Tieren konnte in Genotyp- oder Allelfrequenzen ein signifikanter Unterschied zu den Kontrolltieren festgestellt werden. An der 206. Position vor Beginn des siebten Exons wurde im sechsten Intron des ovinen Transforming Growth Factor, beta1 in der Sequenzanalyse eine Nukleotidsubstitution (G>T) detektiert. Atypisch und klassisch scrapiepositive Tiere sowie Kontrolltiere wurden mit Hilfe eines PCR-ACRS mit dem Enzym BseGI typisiert. Es konnten keine signifikanten Unterschiede in den Genotyp- oder Allelfrequenzen zwischen positiven Tieren und Kontrolltieren festgestellt werden. Für zukünftige Studien würde die Untersuchung funktioneller Kandidatengene in der Nähe der Mikrosatelliten MCMA53, MCMA16 und MCM159 eine mögliche Vorgehensweise darstellen. In der vorliegenden Arbeit konnten keine Hinweise darauf gefunden werden, dass die hier untersuchten Gene einen Einfluss auf die Scrapieresistenz beim Schaf ausüben, weswegen sie für weitere Untersuchungen nicht von großem Interesse sind. Zukünftig ist es anzustreben, genomweit mit Hilfe eines Genchips und mit vergrößertem Probenmaterial auf für die Scrapieresistenz bedeutende Gene zu suchen. The aim of the present study was to screen microsatellites on ovine chromosomes 14 and 15 as well as functional and positional candidate genes for an association with susceptibility for classical and atypical scrapie in sheep.Therefore 102 classical and 71 atypical scrapiecases, identified in Germany during the years 2002 - 2005, were investigated. Controls were ether tested scrapie negative or showed no clinical signs of scrapie infection.Microsatellites MCM159, MCMA53, UWCA5, CSAP26E, CSRD63, BM6507, MCMA16, BMS2812 und RM004 were amplificated in three multiplex PCRs and afterwards separated in gel electrophoresis. Allele frequencies were calculated and compared between scrapie cases and controls with regard to scrapie type. Microsatellites MCMA53 and MCMA16 showed highly significant and significant differences respectively in allele frequencies between atypical scrapie cases and controls. Allele frequencies of microsatellite MCM159 differed significantly between positive and control animals in flocks affected by classical scrapie. These results can be due to genes influencing scrapie susceptibility in sheep which are in linkage disequilibrium with the above-mentioned microsatellites.During sequence analysis a single nucleotide polymorphism (C>T) was identified at the 391st position of the ninth intron of the ovine Cathepsin B gene. Animal samples were screened for the mutation with PCR-RFLP using the enzyme LweI. Significant aberration was neither detected in allele frequencies nor in genotype frequencies of scrapiepositive and control animals.At the twelfth position of the ninth exon of the ovine Cathepsin D gene a silent mutation (C>T) was detected. In case of the wild type allele (C) a potential exon splicing enhancer was detected at this location by the programme ESEfinder 3.0. In case of the mutation (T) this ESE couldn´t be identified any more. Scrapiepositive and control animals were screened for the mutation at the twelfth position of exon nine by the use of PCR-RFLP with the enzyme BseYI. Neither atypical nor classical positive sheep showed significant differences in allele or genotype frequencies compared to control animals.Of the ovine Calpain, Large Polypeptide L2 gene the promoter and part of the first exon were investigated. Spanning the whole region a CpG island including two G/C boxes was identified. Existing sequence motives point to absence of methylation and indicate that Calpain, Large Polypeptide L2 belongs to the class of housekeeping genes. In the promoter region at the 191st base in front of exon one a single nucleotide polymorphism (G>T) was detected. In case of the wild type allele (G) the programme MatInspector identified a potential binding site for the transcription repressor Zinc Finger Protein Insulinoma-associated 1 (IA-1), which could not be detected in the mutated allele (T). Scrapie positive and control animals were tested via ASPCR and indifferent results were confirmed by a nested PCR followed by a RFLP with the enzyme MvaI. Significant differences in genotype or allele frequencies between positive and control animals could be detected in neither scrapie type.At the 392nd position of the fourth intron of the Kallikrein 1 gene a single nucleotide polymorphism (C>T) was identified. For routine testing a PCR-RFLP with the enzyme BsmFI was carried out. Compared to control animals neither in classical nor in atypical scrapiepositive sheep significant differences in genotype or allele frequencies were detected.In the sixth intron of the ovine Transforming Growth Factor, β1 at the 206th base in front of the seventh exon a single nucleotide polymorphism (G>T) was identified during sequence analysis. Atypical and classical scrapie cases and controls were investigated by PCR-ACRS with the enzyme BseGI. In allele and genotype frequencies no significant differences could be detected between scrapie positive and control animals.For future studies investigation of candidate genes in the neighbourhood of microsatellites MCMA53, MCMA16 and MCM159 is a possible approach. In the present study no evidence for an association of the investigated genes with scrapie susceptibility in sheep was detected. Therefore these genes are not of big interest for further studies. In future research a whole genome study using a gene chip and increased sample size should be carried out to screen for gene loci influencing scrapie susceptibility in sheep.