Untersuchungen zur Struktur und Funktion des DNA-Fragmentierungsfaktors DFF

Abstract

In dieser Arbeit ist es gelungen eine Region in der Nuklease CAD zu identifizieren, die intrinsisch unstrukturiert vorliegt, wichtig für die Stabilität der Nuklease ist und somit als eine potentielle chaperone target region für den Inhibitor DFF45 gesehen werden kann. Wie bereits zuvor bekannt war, benötigt CAD zur korrekten Faltung u.a. die Hilfe von DFF45, der neben der inhibitorischen Funktion auch eine Chaperonfunktion aufweist. Durch sogenannte Prädiktoren konnte im Vorfeld eine intrinsisch unstrukturierte Region (IUR) am C-Terminus der Nuklease vorhergesagt werden. Um diese Region deutlich eingrenzen zu können, wurden sechs CAD-Varianten generiert, die jeweils einen Aminosäurerest ausgetauscht haben. Die CAD-Varianten wurden nach erfolgreicher Expression über Affinitäts- und Anionenaustauschchromatographie gereinigt und schließlich in einem Nuklease-Aktivitätsassay und einem DNA-Bindungsassay eingesetzt, um die jeweilige Eigenschaft bezüglich des Aminosäureaustausches zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass zunächst die Stabilität der DFF-Komplexe stark reduziert war, da bereits während der Reinigung die Komplexe zerfielen und somit kaum noch Nuklease gereinigt werden konnte. Da in darauffolgenden Versuchen unterschiedliche CAD-Kozentrationen eingesetzt wurden, konnte demzufolge keine Aussage darüber getroffen werden, ob ein AS-Austausch die DNA-Spalt- oder Bindungseigenschaft von CAD beeinflusst. Man kann jedoch davon ausgehen, dass die Aminosäurereste 322IYR324 im C-terminalen loop der C3-Domäne für die Stabilität der Nuklease und eine Interaktion zwischen Nuklease und Chaperon wichtig sind.CAD liegt in nicht apoptotischen Zellen als heterodimerer Komplex mit dem Inhibitor DFF45 vor, der über eine Chaperonfunktion verfügt. Sobald durch ein apoptotisches Signal eine Enzymkaskade in Gang gesetzt wird und Caspase-3 den Komplex aktiviert, wird DFF45 gespalten und somit CAD aktiviert, das dann als Homodimer seine Nuklease-Aktivität ausübt. In dieser Arbeit sollten artifizielle Heterodimere von CAD generiert, exprimiert und gereinigt werden, um diese schließlich in Nuklease-Aktivitätsassays einsetzen zu können. Dies sollte Aufschluß über den Spaltmechanismus der Nuklease geben. Die Konstrukte konnten zwar erfolgreich generiert, exprimiert und gereinigt werden, jedoch konnten keine künstlichen Heterodimere von CAD erhalten werden. Im Gegensatz dazu zeigten aber die Koimmunopräzipitationsversuche andere interessanten Ergebnisse. So konnte eine Dimerisierung der beiden Inhibitor-Protomere sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit von CAD beobachtet werden, was für einen trimären DFF-Komplex (CAD/ICAD-L2) sprechen würde. Nachdem diese Methode zur Generierung von CAD-Heterodimeren fehl schlug, wurde nun mit Hilfe eines Rapamycin-Analogs versucht eine Heterodimerisierung zu erzwingen. Dazu wurde CAD durch Verwendung von zwei speziellen Vektoren kloniert, mit deren Hilfe eine Dimerisierung zweier CAD-Proteine erzwungen werden sollte. Auch in diesem Fall konnte eine erfolgreiche Generierung und Expression der Proteine verzeichnet werden. Allerdings konnte nach der Reinigung der Proteine nicht mit Sicherheit davon ausgegangen werden, dass es sich um CAD-Heterodimere handelt, was man schließlich auch im Nuklease-Aktivitätsassay beobachten konnte. Somit konnte in diesem Teil der Arbeit leider kein aussagekräftiges Ergebnis erzielt werden. Ein weiteres Ergebnis dieser Arbeit ergab die Untersuchung des DFF-Komplexes bezüglich des induzierten proteasomalen Abbaus. Hierfür wurden die zu untersuchenden Proteine CAD und DFF45 mit einer destabilisierenden Domäne DD fusioniert, durch die eine schnelle Degradation erfolgt. In Anwesenheit eines Stabilisierungsliganden (Shield1) wird jedoch das DD-fusionierte Protein vor einem Abbau geschützt. Es konnte gezeigt werden, dass in einem CAD/DD-DFF45-Komplex der Inhibitor, der DD enthält, von Proteasen abgebaut wird. Die Nuklease wird aufgrund des fehlenden Chaperons nur noch in sehr geringen Mengen exprimiert. Im Gegensatz dazu zeigt ein Komplex bestehend aus DD-CAD/DFF45 lediglich eine Degradation der Nuklease, die in diesem Fall DD besitzt. Ein Abbau des Inhibitors ist nur schwer zu erkennen, da die Expression von DFF45 zu stark war und demzufolge mehr Inhibitor nachgeliefert als abgebaut wurde. Somit konnte durch die Fusion von DD an CAD und die Zugabe von Shield1 die intrazelluläre Nuklease-Konzentration reguliert werden.