Effects of H2O2 at rat myenteric neurones in culture

Abstract

Oxidants, produced e.g. during inflammation, alter gastrointestinal functions finally leading to diarrhea and/or tissue damage. There is only scarce information about the action of oxidants on enteric neurones, which play a central role in the regulation of many gastrointestinal processes. Therefore, the effect of an oxidant, H2O2, on cultured rat myenteric neurones was studied with the whole-cell patch-clamp and imaging (fura-2) techniques. H2O2 (5 mmol/l) induced an increase in the cytosolic Ca2+ concentration. Both an intracellular release via IP3 and ryanodine receptors as well as a Gd3+-sensitive Ca2+ influx contributed to this response. Measurement of the membrane potential revealed that the neuronal membrane hyperpolarized by 11.3 ± 0.8 mV (n = 30) in the presence of H2O2. Inhibition of Ca2+-dependent K+ channels by the BK-specific inhibitor paxilline (10 µmol/l) or by 100 µmol/l TPA (a broad inhibitor of Ca2+-dependent K+ channels) prevented this hyperpolarization. This indicates that the increase in the cytosolic Ca2+ concentration likely activates BK channels, which carry an outward K+ current to hyperpolarize the neuronal membrane.Voltage-clamp experiments revealed a second action of the oxidant, i.e. a strong inhibition of the fast Na+ current responsible for the generation of action potentials. This effect seemed to be mediated by the hydroxyl radical ( OH), as Fe2+ (100 µmol/l), which leads to the generation of this radical from H2O2 via the Fenton reaction, strongly potentiated the action of an ineffective concentration (100 µmol/l) of the oxidant. Inhibition of protein phosphorylation by staurosporine (1 µmol/l), a protein kinase inhibitor, prevented the effect of a subsequent administration of the oxidant. Vice versa, the protein phosphatase (PP) inhibitor calyculin A (100 nmol/l) strongly reduced the inhibition of Na+ current by H2O2. This effect was mimicked by the PP2A specific inhibitor endothall (100 nmol/l), whereas the PP1 blocker tautomycin (3 nmol/l) was less effective. However, none of the inhibitors used was able to significantly change the basal amplitude of the inward sodium current. Changes appeared only after administration of the oxidant, meaning that a preconditioning of the channels or regulatory proteins, e.g. an oxidation of thiol groups by H2O2, is necessary for this action. This was confirmed by the observation that in the presence of the reduced form of GSH (3 mmol/l), H2O2 was unable to inhibit inward sodium currents. These results suggest that H2O2 might act via a shift of the equilibrium between protein phosphorylation and dephosphorylation involved in the regulation of Na+ currents in rat myenteric neurones. The consequence is an inhibition of the sodium currents responsible for the generation of action potentials. Together with the hyperpolarization, H2O2 should likely reduce the ongoing inhibitory tone of the ENS on the gastrointestinal muscle, which might result in a hypercontractility leading to diarrhea. Oxidantien, die z.B. während Entzündungsprozessen entstehen, beeinflussen Funktionen des Magen-Darm-Trakts, was im Endeffekt zu Durchfall und/oder Gewebeschäden führt. Es gibt nur wenige Daten über die Wirkung von Oxidantien an enteralen Neuronen, welche eine zentrale Rolle bei der Regulation vieler gastrointestinaler Prozesse spielen. Daher wurde mit der Hilfe von Whole-cell Patch-Clamp- und Imaging (Fura-2)-Techniken die Wirkung des Oxidationsmittels H2O2 an kultivierten myenterischen Neuronen aus der Ratte untersucht.Das Oxidationsmittel H2O2 (5 mmol/1) löste einen Anstieg der zytosolischen Ca2+ Konzentration aus. Sowohl eine intrazelluläre Freisetzung von Ca2+ über IP3- und Ryanodin-Rezeptoren als auch ein Gd3+-sensitiver Einstrom von Ca2+ sind an dieser Antwort beteiligt. Messung des Membranpotentials ergab, dass die Membran der myenterischen Neurone in Gegenwart von H2O2 um 11,3 ± 0,8 mV (n = 30) hyperpolarisierte. Die Hemmung von Ca2+-abhängigen K+-Kanälen durch den BK-spezifischen Inhibitor Paxillin (10 µmol/l) oder durch 100 µmol/l TPA (ein breit wirkender Blocker Ca2+-abhängiger K+-Kanäle) verhinderte diese Hyperpolarisation. Dies deutet darauf hin, dass der Anstieg der zytosolischen Ca2+ Konzentration wahrscheinlich BK-Kanäle aktiviert: diese Kanäle erlauben einen K+-Auswärtsstrom, der die Hyperpolarization bedingt. Spannungsklemm-Experimente deckten eine zweite Wirkung des Oxidationsmittels auf: Eine starke Hemmung des schnellen Na+-Stromes, der für die Erzeugung der Aktionspotentiale zuständig ist. Dieser Effekt scheint von dem Hydroxyl-Radikal ( OH) vermittelt zu sein, denn Fe2+ (100 µmol/l), das zur Erzeugung dieses Radikals aus H2O2 über die Fenton-Reaktion führt, potenzierte die Wirkung einer unwirksamen Konzentration (100 µmol/l) an H2O2. Die Hemmung der Protein-Phosphorylierung durch Staurosporin (1 µmol/l), einen Proteinkinase-Blocker, verhinderte die Wirkung des Oxidationsmittels. Umgekehrt reduzierte auch der Proteinphosphatase (PP)-Blocker Calyculin A (100 nmol/l) stark die von H2O2 induzierte Hemmung des Na+-Stromes. Dieser Effekt wurde durch den PP2A spezifischen Hemmer Endothall (100 nmol/l) nachgeahmt, während der PP1-Blocker Tautomycin (3 nmol/l) weniger wirksam war. Allerdings war keiner der verwendeten Inhibitoren in der Lage, die basale Amplitude des Na+-Einwärtsstroms zu beeinflussen. Änderungen erschienen erst nach der Zugabe des Oxidationsmittels, was bedeutet, dass eine Vorkonditionierung der Kanäle oder regulatorischer Proteine, wie zum Beispiel eine H2O2-bedingte Oxidation von Thiolgruppen, für diese Aktion notwendig ist. Dies wurde durch die Beobachtung, dass in Anwesenheit der reduzierten Form von GSH (3 mmol/l) H2O2 nicht in der Lage war, Na+-Einswärtsströme hemmen, untermauert.Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Oxidantien durch Veränderungen am enterischen Nervensystem Änderungen der gastrointestinalen Motilität auslösen können.