Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von Pradofloxacin in einem "Tissue-Cage"-Modell beim Hund

Abstract

Pradofloxacin (PRA), ein neues Fluorochinolon, wird zur Behandlung bakterieller Infektionen bei Hund und Katze entwickelt. Dabei müssen u. a. die Pharmakokinetik und die antibakterielle Effektivität von PRA erfasst werden. Als Grundlage für die Pharmakokinetik dient der Konzentrationsverlauf des Wirkstoffs im Serum. Bakterielle Infektionen treten jedoch meist im extrazellulären Bereich der Gewebe auf. Daher wurde ein sog. Tissue-Cage -Modell etabliert. Tissue-Cages (TCs) sind perforierte Hohlkörper. Durch ihre Implantation wird ein künstlicher Hohlraum im Gewebe geschaffen, in welchem sich Tissue-Cage-Fluid (TCF) ansammelt, das repräsentativ für die Interstitialflüssigkeit ist. Somit konnte die PRA-Konzentration in Serum und Interstitialflüssigkeit (TCF, Transsudat und Exsudat) bestimmt und verglichen werden. Weiterhin sollte die tatsächliche antibakterielle Aktivität von PRA unter annähernd physiologischen Bedingungen im TCF bestimmt werden.6 Beagle-Hündinnen wurden jeweils 3 TCs subkutan implantiert. Nach vollständiger Einheilung erfolgte die Applikation von 3 mg/kg KG Pradofloxacin 2,5 % Oral Suspension an 5 aufeinanderfolgenden Tagen (Studie 1 und 2) bzw. einmalig (Studie 3). Zur Gewinnung von Exsudat wurde zeitgleich zur 1. PRA-Applikation (Studie 2 und 3) durch Injektion einer 1%igen Carrageenan-Lösung eine sterile Entzündung in jeweils einem der TCs induziert. Blut- sowie Trans- und Exsudatproben wurden entnommen, zentrifugiert und mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie auf ihren PRA-Gehalt untersucht. Zur Abschätzung der antibakteriellen Aktivität diente: 1) die Bestimmung der minimalen Hemmstoffkonzentration (MHK) von PRA gegenüber E. coli ATCC 8739 und S. aureus ATCC 6538 in Transsudat, 2) die Erstellung von Abtötungskinetiken in Transsudat sowie 3) die Ermittlung postantibiotischer Effekte von PRA gegenüber S. aureus in Transsudat. Zudem wurden im Rahmen der 3. Studie nach 8 h (Cmax im TCF) und nach 24 h (Ende des Dosierungsintervalls) TCF-Proben aliquotiert, mit jeweils ca. 4 x 10^6 KBE/ml von E. coli und S. aureus dotiert und bei 37 °C inkubiert. Daraus wurden Proben zur Bestimmung der KBE/ml entnommen, um das antibakterielle Potenzial von PRA bei tatsächlichem Wirkstoffgehalt nach oraler PRA-Applikation zu prüfen. Die mittlere maximale Konzentration (Cmax) von PRA im Exsudat überstieg die im Transsudat, jedoch konnte diesbezüglich kein statistisch signifikanter Unterschied festgestellt werden. In allen Studien zeigte sich ein statistisch signifikanter Unterschied bezüglich der PRA-Konzentration in Serum und TCF. Die mittlere maximale PRA-Konzentration in Transsudat lag nach der 1. Applikation bei etwa 44 bis 52 % und nach der 5. Applikation bei 55 bis 63 % des mittleren Cmax-Wertes im Serum. Für Exsudat konnte nach der 1. Applikation eine mittlere maximale PRA-Konzentration von fast 56 % und nach der 5. Applikation von ca. 74 % der mittleren maximalen Serumkonzentration festgestellt werden. In der 3. Studie betrug der Cmax-Wert von PRA in Trans- und Exsudat nur 40 % der mittleren maximalen Serumkonzentration. Wie eine histopathologische Untersuchung der TCs zeigte, erklärt sich dies durch die zunehmende Verweildauer der TCs im Körper, da die TCs von einer Gewebekapsel umgeben und die Perforationen der TCs mit der Zeit von Bindegewebe ausgefüllt werden, wodurch die Diffusion in den TC erschwert wird. Cmax wurde im Serum nach etwa 2 h und im TCF nach 8 h erreicht. Die Fläche unter der Kurve (AUC) in Trans- und Exsudat war nach der 1. Applikation bzw. Einfachapplikation geringer als im Serum. Im steady state jedoch wurde in Trans- und Exsudat eine höhere Gesamtexposition erreicht.Für PRA sowie für Enrofloxacin (ENR) als Referenzprodukt ergab sich für E. coli und für S. aureus in Transsudat eine Erhöhung der MHK um das 2- bis 3-fache im Vergleich zu Standard-Testbedingungen. Abtötungskinetiken zeigten in Transsudat eine stärkere bakterizide Aktivität von PRA gegenüber beiden Referenzkeimen als in Nährmedium. Zur Bestimmung des postantibiotischen Effekts (PAE) von PRA gegenüber S. aureus wurde eine Population hoher Dichte (10^9 KBE/ml) kurzzeitig einer im Zieltier maximal erreichbaren Wirkstoffkonzentration ausgesetzt. Der PAE in Transsudat war mit 0,4 h kürzer als in Caso-Bouillon (2 h). Unter Berücksichtigung der unterschiedlichen MHK-Werte für S. aureus in Transsudat (0,12 µg/ml) und Nährmedium (0,06 µg/ml), entsprachen sich die postantibiotischen Sub-MHK-Effekte (PA-SME) bei ½ MHK in den beiden Medien (17 bzw. 18 h). Bei einer ¾ MHK zeigte sich in Transsudat eine 10 h andauernde Abtötung mit anschließender Bakteriostase bis zu 24 h, so dass das Dosierungsintervall durch den PA-SME offenbar vollständig abgedeckt wurde. In Proben mit authentischem Wirkstoffgehalt nach oraler PRA-Applikation zeigte sich eine fortdauernde und hohe antibakterielle Wirksamkeit gegenüber E. coli und S. aureus, auch noch am Ende des Dosierungsintervalls. Pradofloxacin (PRA), a new fluoroquinolone, is being developed to treat bacterial infections in dogs and cats. The pharmacokinetic and antibacterial potential of PRA were therefore evaluated. The basis of pharmacokinetic analysis is the determination of concentration-time-profiles in serum. However, bacterial infections normally take place in the extracellular compartment of tissues. For this reason, a tissue cage model has been established. Tissue cages (TCs) are perforated hollow devices. Through their implantation in the tissue, an artificial cavity is created in which fluid (tissue cage fluid, TCF) accumulates which is representative of interstitial fluid. Hence, the accurate concentration of PRA in serum and interstitial fluid (TCF, transudate and exudate) could be determined and compared. Furthermore, the actual antibacterial activity of PRA in TCF had to be investigated under almost physiological conditions.Three TCs per animal were subcutaneously implanted in six female Beagle dogs. After complete recovery from surgery, pradofloxacin 2.5 % oral suspension (3 mg/kg b. w.) was administered to the dogs for five consecutive days (study 1 and 2) and also as a single administration (study 3). To generate inflammatory exudates, a 1 % carrageenan solution was injected into a single TC in each animal simultaneously with application of PRA (study 2 and 3). Blood, transudate and exudate samples were drawn, centrifuged and analyzed for their PRA concentration by turbulent flow chromatography/tandem mass spectrometry. For the estimation of the antibacterial activity served: 1) the determination of PRA MICs against E.coli ATCC 8739 and S. aureus ATCC 6538 in transudate, 2) the performance of kill kinetics in transudate and 3) the investigation of postantibiotic effects (PAE) of PRA against S. aureus in transudate. Moreover, during study 3 TCF samples were aliquotted after 8 h (expected maximum concentration of PRA in TCF) and after 24 h (end of dosing interval), inoculated with either 4 x 10^6 cfu/mL of E. coli or S. aureus and incubated at 37°C to examine the antibacterial activity of PRA in samples with authentic concentrations. The mean maximum concentration of PRA in exudate exceeded the concentration in transudate; however, a statistically significant difference could not be determined. There was a statistically significant difference concerning the PRA concentration in serum and TCF in all studies. The mean maximum concentration of PRA in transudate was approximately 44 to 52 % after the first application and 55 to 63 % of the mean serum concentration after the fifth application. In exudate a mean maximum PRA concentration of nearly 56 % after the first application and of approximately 74 % of the mean maximum serum concentration after the fifth application could be determined. In study 3 the mean maximum concentration of PRA (Cmax) in transudate and exudate reached only 40% of the mean maximum serum concentration. As a histopathological investigation of the TCs showed, this can be explained by the longer residence time of the TCs in the body which results in an increasing growth of tissue into and around the TCs so that the diffusion into the TCs was hindered. Cmax was achieved after approximately 2 h in serum and after 8 h in TCF. After the first application and after single application respectively, the AUC in transudate and exudate was smaller than in serum. At steady state, however, a higher total drug exposition was reached in transudate and exudate.For PRA as well as for enrofloxacin (ENR), as reference product, there was a 2- up to 3-fold increase of MIC against E. coli and S. aureus in transudate compared to standard test conditions. Kill kinetics showed a stronger bactericidal activity of PRA in transudate than in growth medium against both reference organisms. To determine the PAE of PRA on S. aureus, a population of high density (10^9 cfu/mL) was exposed short-term to a PRA concentration maximally attainable in the target animal. The PAE in transudate (0.4 h) was shorter than in broth (2 h). Considering the different MIC values of PRA against S. aureus in transudate (0.12 µg/mL) and growth medium (0.06 µg/mL), postantibiotic sub-MIC effects (PA-SME) were nearly equal in the two media (17 h/18 h) at ½ MIC. At ¾ MIC killing could be observed in transudate up to 10 h followed by bacteriostatic activity up to 24 h, therefore the dosage interval was completely covered by the PA-SME. Samples with authentic PRA concentrations showed a continuing and high antibacterial activity against E. coli and S. aureus even at the end of the dosage interval.