Identifizierung neuer Enzyme des Mevalonat-unabhängigen Methylerythritol-4-phosphat-Stoffwechselweges zur Isoprenoidbiosynthese

Abstract

Der Mevalonat (MVA)-unabhängige Methylerythritol-4-phosphat (MEP)-Stoffwechselweg zur Biosynthese von Isoprenoiden wurde erst vorwenigen Jahren in Bakterien und in den pflanzlichen Plastiden identifiziert. Da dieser für viele Organismen essentielle Stoffwechselweg imMenschen nicht vorkommt, stellen die beteiligten Enzyme geeignete Zielstrukturen für die Entwicklung neuer antimikrobieller Wirkstoffe dar. Zu Beginn dieser Arbeit waren nur zwei Enzyme, die 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat (DOXP)-Synthase (DXS) undDOXP-Reduktoisomerase (DXR) bekannt, die die ersten beiden Reaktionsschritte des MEP-Stoffwechselweges katalysieren. Mit Hilfevon bioinformatischen Ansätzen konnten verschiedene Gene identifiziert werden, die möglicherweise für noch unbekannte Enzyme desMEP-Stoffwechselweges kodieren. Um die Beteiligung dieser Gene an dem MEP-Stoffwechselweg zu beweisen, wurde ein genetischerAnsatz gewählt. Hierzu wurden zuerst genetisch veränderte Escherichia coli-Bakterien generiert, die in der Lage sind,Isopentenylpyrophosphat aus exogenem Mevalonat zu synthetisieren. Dazu wurde ein künstliches Operon konstruiert, das den E.coli-Bakterien die Expression der Hefe-Gene der MVA-Kinase (MVK), Phospho-MVA-Kinase (PMK) und derMVA-pyrophosphat-Decarboxylase (MPD) erlaubt. In diesen Bakterien konnten im MEP-Stoffwechselweg involvierte Gene deletiertwerden. Dabei wurden die Gene gcpE und lytB als neue Gene des MEP-Stoffwechselweges in E. coli identifiziert. Zellen mit Deletionendieser Gene konnten nur überleben, wenn das Medium mit Mevalonat supplementiert worden war oder die Zellen eine entsprechendeepisomale Kopie des jeweiligen Genes enthielten. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, daß ein bisher unbekanntes Intermediat des MEP-Stoffwechselweges zur Aktivierung vonpolyklonalen Vg9Vd2 T-Zellen des menschlichen Immunsystems verantwortlich ist. Deshalb wurden die generierten Deletionsmutanten ingd T-Zellaktivierungs-Experimente eingesetzt. Hierbei stellte sich heraus, daß gcpE-Gendeletionsmutanten ihr gdT-Zellaktivierungspotential fast vollständig verloren hatten, während lytB-Gendeletionsmutanten ein über 100-fach höheres Potential als derWildtyp besaßen. Als gd T-Zellaktivator konnte eine Substanz isoliert werden, deren Struktur als(E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMBPP) aufgeklärt wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, daß HMBPP ein neuesIntermediat des MEP-Stoffwechselweges ist und das Produkt von GcpE und das Substrat von LytB darstellt.