Identifikation differentiell exprimierter Gene der Gerste (Hordeum vulgare L.) nach BYDV-PAV Infektion anhand von cDNA-AFLP

Abstract

Die blattlausübertragene Gelbverzwergung der Gerste, verursacht durch verschiedene Stämme des Barley yellow dwarf virus (BYDV) und des Cereal yellow dwarf virus (CYDV), ist eine weltweit bedeutende Virose der Poaceae, die erhebliche Ertragsverluste zur Folge haben kann. Für eine sowohl wirtschaftlich tragfähige als auch ökologisch verträgliche Getreideproduktion ist ein Anbau toleranter Genotypen erforderlich. Eine effiziente Züchtung toleranter Gerstensorten setzt die Verfügbarkeit molekularer Selektionsmarker voraus, da eine phänotypische Selektion nach künstlicher Infektion mittels virustragender Blattläuse nur schwer in den Zuchtgang zu intergrieren ist. Ziel dieser Arbeiten war es daher mittels cDNA-AFLP Gene zu identifizieren, die an der Ausprägung der Toleranzreaktion beteiligt sind und diese in einer phänotypisch charakterisierten Population von DH-Linien zu kartieren.Die Charakterisierung der Genexpression in den Linien Post´ und Vixen´, sowie ausgewählten doppelhaploiden (DH) Linien der Kreuzung Post´ x Vixen´ mit der cDNA-AFLP Technik ergab insgesamt 45 differentiell regulierte Gene mit folgender Verteilung: 13% Kohlenhydratmetabolismus, 11% Aminosäurebiosynthese, 11% Seneszenz assoziiert, 7% Zellwandsynthese, 2% BYDV-Reaktion, 16% mRNAs anderer Klassen, 9% ohne signifikante Übereinstimmung und 31% mRNAs unbekannter Funktion. Von sieben differenzierenden Fragmenten konnten Marker als STS, CAPS oder SNPs entwickelt werden, mit denen die gefundenen Unterschiede in der vorhandenen DH-Population DH21 Post´ x Vixen´ kartiert werden konnten. Die abgeleiteten Marker der im cDNA-AFLP gefundenen Fragmente kartierten in der Untersuchungspopulation nicht im Bereich bisher bekannter QTL. Für einige Sequenzen ließ sich die chromosomale Zuordnung über Weizen-Gerste Additionslinien bestimmen, ohne eine genaue Aussage über die Position auf dem jeweiligen Chromosom treffen zu können. Die im cDNA-AFLP identifizierten Genfragmente, insbesondere Enzyme der Aminosäurebiosynthesewege betreffend, sind vermutlich auf sekundäre Pflanzenreaktionen nach einer BYDV-Infektion zurückzuführen, da insbesondere eine hohe Akkumulation von Kohlenhydraten in den Blättern BYDV-infzierter Pflanzen auf eine gestörte Phloemfunktion zurückgeführt werden kann. Saccharose kann von den Source-Organen nicht in das Phloem entladen werden und reichert sich daher an. Als Folge wird die Saccharose ggf. wieder in Fructose und Glucose gespalten, was zum einen vielfältige Feedback Funktionen auf weitere Prozesse des Kohlenhydratmetabolismus auslöst und zum anderen, als Folge der Anreicherung von löslichen Zuckern in der Pflanze, zu starken Chlorosen führen kann. Die Desorganisation des Phloemgewebes nach einer BYDV Infektion konnte mit den im cDNA-AFLP gefundenen Enzymen nicht abschließend erklärt werden. Indes lassen Erkenntnisse über herunterregulierte Enzyme der Zellwandsynthese nach einer BYDV-Infektion die Vermutung zu, dass unvernetzte Zellwandbestandteile sich im Phloem anreichern und es somit zu einem Verschluß der Siebzellen mit der Folge von Chlorosen und Leistungsminderungen kommen kann. Aphid transmitted Barley yellow dwarf, caused by different strains of Barley yellow dwarf virus (BYDV) and Cereal yellow dwarf virus (CYDV) is an important virosis of Poaceae worldwide and causes substantial yield losses. For an economical and ecologically sound production of cereals growing of tolerant cultivars is a prerequisite. For efficient breeding of tolerant barley (Hordeum vulgare L.) cultivars molecular markers are useful tools since artifical inoculation using virus bearing aphids can hardy be efficiently implemented in a barley breeding programme. Therefore, this study aimed at the identification of genes involved in BYDV tolerance by cDNA-AFLP followed by mapping of these genes in a phenotypically well characterized DH-line population derived from the cross Vixen´ (Ryd2) and Post´ (QTL on 2HL). In order to achieve information on genes differentially expressed after BYDV infection in general and differentiating tolerant and non-tolerant genotypes, the parental cultivars and doubled haploid (DH) lines derived from their cross carrying all possible combinations of positive and negative alleles at respective loci (Ryd2, QTL on 2HL) as well as the non-tolerant cultivar Nixe´ were raised in growth chambers (18°C, 70% relative humidity, 16 h light period, illumination level of 1e4 lm/sm). Artificial inoculation took place in the one-leaf stage with aphids (Rhopalosiphum padi) carrying the BYDV-PAV-ASL-Isolate. At 2 dpi the aphids were removed with a systemic insecticide, and 15 dpi the success of artificial infection was checked by analysing the tip of the third leaf by DAS-ELISA. The rest of this leaf was used for total RNA extraction, based on a method using guanidinium thiocyanate. Selective isolation of mRNA was carried out with magnetic beads and the mRNA of infected and healthy control plants was reverse-transcribed to double-stranded cDNA. AFLP reactions were applied and subsequently analysed by 256 EcoRI+2/MseI+2 primer combinations. Differentiating fragments were cut out of electrophoresis gels and re-amplified by using the corresponding +2 primer combinations. Re-amplified fragments were cloned and sequenced. Sequences were compared to EST and protein databases on the worldwide web. A total of 45 differentially regulated genes could be examined and attributed to functions as follows: 13% carbohydrate metabolism, 11% aminoacid biosynthesis, 11% senescence associated, 7% cell wall synthesis, 2% BYDV, 16% mRNA of other classes, 9% without significant similarities and 31% mRNA of unknown function. Out of seven different fragments STS, CAPS and SNP markers were derived and mapped in the existing DH population Post´ x Vixen´. Out of the derived markers of the isolated fragments from the cDNA-AFLP, no one mapped in the DH21 population Post´ x Vixen´ at known tolerance loci or QTL regions. Some sequences could be assigned to barley chromosomes (1H-7H) with wheat-barley chromosome addition lines, but the exact position on the repective chromosome can not be determined by this approach.The detected gene fragments, especially from the amino acid biosynthesis pathways, possibly play a role in secondary plant reactions after BYDV infection because the high accumulation of carbohydrates in BYDV infected leaves most probabaly resulted from degeneration of the phloem. Accumulation of sucrose in source-organs is the consequence of a distorted phloem loading. On the one hand the plethora of sucrose gets cleaved in fructose and glucose with manifold feedback processeses in the carbohydrate metabolism and, on the other hand, it results in severe chlorosis as a result of the enrichment of soluble carbohydrates in the leaf. The reason for distorted phloem transport could not be clarified but the identification of down-regulated genes from cell wall synthesis after BYDV infection allow to presume that uncured fragments of the cell wall accumulate in the phloem, block the sieve cells, cause chlorosis and finally lead to plant damage and yield reduction.