Pigmentsynthese bei Exophiala dermatitidis : Einfluss auf Phagozytose und Oxidative Burst

Abstract

Indolderivate wurden von der Arbeitsgruppe um Prof. Mayser 1998 erstmals bei der HefeMalassezia furfur beschrieben, bei der sie vermutlich in einem klinischen Zusammenhang mitder Hautkrankheit Pityriasis versicolor stehen. Im Jahr 2006 konnten Nies et al. solcheIndolderivate erstmals bei Exophiala dermatitidis nachweisen. Ziel der vorliegenden Arbeitwar die vergleichende Untersuchung der Pigmentspektren verschiedener Stämme vonExophiala dermatitidis und ihre Überprüfung auf eine mögliche Rolle in der Pathogenese vonExophiala-dermatitidis-Infektionen.Hierfür wurden der Wildtyp und seine Mutanten Mel-1, Mel-3 und Mel-4 zurPigmentsynthese auf 1b-Minimalagar angezüchtet. Nach vierwöchiger Wachstumsphasewurde das dabei entstandene Pigment als Rohextrakt gewonnen, durch chromatographischeMethoden vorgereinigt, sowie einzelne farbige Bestandteile weiter aufgereinigt. DieStukturaufklärung isolierter Reinsubstanzen erfolgte an der TU München. Grundlage zurUntersuchung des Oxidative Burst stellte der von Schnitzler et al. (1999) etablierteVollblutansatz mit Dihydrorhodamine 123 als Indikator für die Sauerstoffradikalsynthese vonneutrophilen Granulozyten dar. Die anschließende Messung erfolgte am Durchflußzytometer.Im Rahmen der Untersuchung der Pigmentspektren konnte beim Wildtyp von Exophialadermatitidis erstmals die Synthese von Pityriacitrin, Pityriarubin C, Exophialin undDesoxyexophialin nachgewiesen werden.Für die Mutante Mel-1 konnte erstmals das bislang nur durch vergleichende DCnachgewiesene Pityriacitrin in der HPLC, sowie durch Analyse der TU München bestätigtwerden. Desweiteren konnte Exophialin aus zwei violetten Banden mit einem Rf-Wert von0,38 und 0,56 isoliert werden.Unter den Syntheseprodukten der Mutante Mel-3 wurde erstmals Exophialin, Pityriarubin Cund Pityriacitrin nachgewiesen.Beim Vergleich des Wildtyps von Exophiala dermatitidis mit seiner Melaninmangel-MutanteMel-3 hinsichtlich ihrer Auswirkung auf den Oxidative Burst in Vollblutproben konnte einedeutliche Hemmung des Oxidative Burst durch den Wildtyp gegenüber Mel-3 aufgezeigtwerden. Dies läßt den Rückschluß auf eine deutliche Schutzwirkung des vom Wildtypsynthetisierten Melanins vor der ROS-Synthese zu.Auch die untersuchten Pigment-Rohextrakte von Wildtyp, Mel-1, Mel-3 und Mel-4 hatten alleeine hemmende Wirkung auf die ROS-Synthese, wobei der Rohextrakt von Mel-3 denstärksten Einfluß hatte.Bei den Sephadex-Fraktionen der Mutante Mel-3 ergaben unterschiedliche Einflüsse auf dieROS-Synthese. Die Fraktionen zwei und sechs zeigten in allen Zeitstufen zwischen 0 und 60Minuten die stärkste Unterdrückung, wohingegen bei den Fraktionen drei und acht zu keinemZeitpunkt Auswirkungen auf die ROS-Synthese beobachtet wurden.Nach weiterer Unterteilung der hemmenden Fraktion sechs der Mutante Mel-3 mittelspräparativer Dünnschichtchromatographie in acht Banden konnte eine deutliche Hemmungdes Oxidative Burst durch die Banden 5-8 verzeichnet werden. In diesem Bereich kam nebenzahlreichen Fluorochromen und Pityriarubin C eine prominente Bande von grauer Farbe vor.Diese Substanz hemmte die ROS-Synthese deutlich, wohingegen Pityriarubin C keinenEinfluß darauf hatte. Auch die acht Banden der Fraktion zwei der Mutante Mel-3unterschieden sich in ihrer Auswirkung auf den Oxidative Burst. Hier wirkten sich nur dieFraktionen 1,4,5 hemmend auf die ROS-Synthese aus.Die weiterhin untersuchten Reinsubstanzen Exophialin und Malassezin hatten selbst in hohenKonzentrationen keinen signifikanten Einfluß auf die ROS-Synthese.Insgesamt konnte gezeigt werden, daß Exophiala dermatitidis Wildtyp und seine Mutantenunter den eingesetzten Anzuchtbedingungen ein sehr unterschiedliches Spektrum anpigmentierten Indolderivaten bilden, das sich stets reproduzieren ließ. Es wurde eineHemmung der ROS-Synthese durch diese Pigmente in Form von Rohextrakten einzelnerStämme, in Form weiter aufgereinigten Säulenchromatographie-Fraktionen, sowie in Formvon Einzelbanden beobachtet. Die läßt Rückschlüsse auf deren wichtige Rolle in derPathogenese von Exophiala dermatitidis-Infektionen bei Mensch und Tier zu. Die aus diesenResultaten hervorgehenden neuen Fragestellungen sind weiteren Untersuchungenvorbehalten. In 1998, the working group of Prof. Mayser first described some particular indole derivativesin the yeast Malassezia furfur, which might be clinically related to the skin disease pityriasisversicolor. In 2006, Nies et al. were the first ones able to show the production of these indolederivatives in Exophiala dermatitidis. The aim of this study was to compare the pigmentspectrum of different species of Exophiala dermatitidis and to clarify whether they are part ofthe pathogenese of infections with Exophiala dermatitidis.The wildtype and its mutants Mel-1, Mel-3 and Mel-4 were cultivated on minimal agar as abase for pigment production. The pigment was extracted after a period of growth of 4 weeksand chromatographically purified to obtain pure substances. Structural analyses of the isolatedsubstances were performed at Munich Technological University. Following the studies ofSchnitzler et al. (1999), unlabeled yeast cells were incubated in heparinized whole blood anddihydrorhodamine 123 was added as an indicator for the ROS-synthesis in the granulocytes.Flow cytometric analysis was performed in a FACScan flow cytometer.By investigating the pigment spectrum of Exophiala dermatitidis, the synthesis ofPityriacitrin, Pityriarubin C, Exophialin and Desoxyexophialin in the wildtype could beshown.In former studies, the pigments of the mutant Mel-1 were already investigated by comparativeDC and the indole pyruvate Pityriacitrin was found to be produced by this yeast. In thepresent study, this achievement could be approved by HPLC and the analysis of MunichTechnological University. Exophialin, an almost ankwown indole derivate which was isolatedfrom Mel-3 for the first time by Nies et al. (2006) was found in two violet DC-bands of Mel-1(Rf=0,38; Rf=0,56).The indole derivates Exophialin, Pityriarubin C and Pityriacitrin were detected in the mutantMel-3 in this present study.The degree of the oxidative burst evoked by Exophiala dermatitidis wildtype was found to belower when it was compared with its mutant Mel-3. The wildtype is probably protected fromthe oxidative burst by its synthesised Melanin.When the raw extracts of the wildtype, Mel-1, Mel-3 and Mel-4 were added in theexperimental series of oxidative burst, evoked oxidative burst levels were also found to belower compared with the contol without any indole derivates. The raw extract of Mel-3inhibited the oxidative burst most. The sephadex-fractions of the mutant Mel-3 had differentinfluences on the synthesis of ROS. Fractions two and six suppressed the oxidative burst in alltime levels between 0 and 60 minutes strongly, while fractions three and eight had noinfluence on the synthesis of ROS at any time.Fraction six was subdivided by preparative thin layer chromatography into eight bands andthe bands 5-8 were able to inhibit evoked oxidative burst levels. Beside the already knownPityriarubin C and other fluorochromes these three bands 5-8 include an unknown greycolouredpigment. This grey pigment was able to inhibit the synthesis of ROS strongly, whilePityriarubin C had no influence on the evoked oxidative burst. The eight bands of fraction twoof the mutant Mel-3 differed in the way tey influenzed the oxidative burst. Only fractions1,4,5 led to a decreased oxidative burst level. Although added in high concentrations, the puresubstances Exophialin and Malassezin did not have any influence on the synthesis of ROS.I summary can be said that the wildtype of Exophiala dermatitidis an its mutants are able toproduce a very bright and different spectrum of pigmented indole derivates when cultivatedon minimal agar. This pigment spectrum is reproducable at any time. An inhibition of theROS synthesis was shown by these indole derivates when they were added as raw extracts,fractions of thin layer chromatographie and as single bunches. The indole derivates seem toplay an important role in the pathogenesis of infections in human beings and animals causedby Exophiala dermatitidis.