Bioinformatisch unterstützte Hochdurchsatz-Analyse molekularbiologischer und zellbiologischer Prozesse der Regenerationsvorgänge im Herzen des Molches Notophthalmus viridescens

Abstract

Der Molch N. viridescens ist ein Organismus mit außergewöhnlichen Fähigkeiten im Bereich der Regeneration. Gemessen an seiner enormen Bedeutung für die Regenerationsforschung ist jedoch sehr wenig über ihn bekannt. Es bestehen kaum öffentlich verfügbare Informationen zu Genom oder Proteom. Außerdem liegen kaum angepasste molekularbiologische Methoden vor. Dennoch stellt der Molch aufgrund seiner außergewöhnlichen Fähigkeiten, insbesondere im Bereich der Herzregeneration, einen unverzichtbaren Modellorganismus dar.In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass trotz dieser benannten Einschränkungen der Einsatz von modernen Hochdurchsatzmethoden möglich ist. So wurden neben der Anpassung von Methoden zur Transkriptionsanalyse auf cDNA Microarray Basis eine neue Methode zur Proteomanalyse unter Verwendung von SILAC entwickelt. Mit diesen Methoden konnten wesentliche Anteile der transkriptionellen Antwort auf gezielte Schädigungen entschlüsselt werden. Eine wesentliche Grundlage für diese beiden Hochdurchsatztechniken stellt die ebenfalls in der Arbeit beschriebene EST Bibliothek dar. Der normalisierte Datensatz, bestehend aus ~ 100.000 Einzelklonen, dazu ~50.000 Einzelsequenzen (ESTs), die nach Assemblierung zu ~26.000 sequenziell unterschiedlichen Transkripten (Contigs) zusammengefasst werden konnten, beschreibt die Herzregeneration bereits tiefgehend. Dieser Sequenzdatensatz wurde unter Verwendung bioinformatischer Methoden annotiert. Auf der Basis dieses annotierten Sequenzdatensatzes wurde ein cDNA Microarray erstellt, mit dessen Hilfe die Herzregeneration in einer umfangreichen Beobachtungszeitreihe untersucht werden konnte. Es wurde exemplarisch gezeigt, dass insbesondere die frühe Wundantwort entscheidende Ansatzpunkte für die Regeneration liefert. Insbesondere das Vorkommen vieler bekannter immediate early genes, wie beispielsweise fos und jun, verschiedene Transkriptionsfaktoren, Metalloproteasen und Mitglieder der CCN Familie, zeigen, dass auch im Molchherzen grundsätzliche, vielfach bekannte Mechanismen einsetzen, die so auch eine Wundheilung bei höheren Organismen einleiten. Einige Besonderheiten, die die Wundantwort des Molches von denen höherer Organismen unterscheiden, wie beispielsweise die Abregulation des primären und sekundären Aktivierungsweges des Komplementsystems oder die sehr kurzfristige Expression von BTG2, sind erste Hinweise auf potentielle Kandidaten, die eine veränderte Wundantwort hin zu einer regenerativen Antwort mitgestalten könnten. Neben der Transkriptomanalyse auf Basis von cDNA Microarrays wurde mit der massenspektrometrischen Untersuchung von regenerierendem Molchgewebe eine bisher für diesen Organismus noch nicht genutzte Methode eingesetzt. In diesem Bereich wurden schwerpunktmäßig die Felder i) Proteinmarkierung mit stabilen Isotopen, ii) Peptididentifizierung in organismusfremden Datenbanken, iii) Erweiterung des identifizierten Peptidspektrums durch die Verwendung mehrerer Datenbanken, iv) Nutzbarmachung einer EST Sequenzbank, v) unterschiedliche Proteinidentifizierungen in unterschiedlichen Regenerationszeitpunkten und vi) die Identifizierung von bislang unbekannten kodierenden Sequenzen bearbeitet. Es konnte zunächst in einem Experiment zur Schwanzregeneration gezeigt werden, dass sich Molche durch Fütterung mit schweren essentiellen Aminosäuren in Form von Lebergewebe markieren lassen. Weiterhin konnten durch den Einsatz mehrerer organismusfremder Datenbanken zur Peptididentifizierung im Schwanz über 1000 unterschiedliche Proteine identifiziert werden. Der Einsatz einer vorläufigen EST Bank erbrachte ~450 unterschiedliche Proteine. Eine umfangreichere Versuchsreihe zur frühen Herzregeneration auf der neu erstellten cDNA Bank und unter Ausnutzung der neu erarbeiteten Methode ermöglichte über 3000 Proteinidentifizierungen in der normalisierten EST Sequenzdatenbank. Der Einsatz der Lysin markierten Proteine diente dabei der verbesserten Peptididentifizierung. Der Einsatz einer kombinierten Proteindatenbanksuche erbrachte über 4000 identifizierte Proteine. Weiterhin konnte durch die SILAC Markierung die Grundlage für eine spätere Quantifizierung der Proteine gelegt werden. Innerhalb der über 3000 detektierten Proteine der EST Bank konnte eine Gruppe von 109 hochwertig detektierten Proteingruppen isoliert werden, die ausschließlich eine EST Homologie zu den nahen Verwandten wie Xenopus und Ambystoma, oder gar keine Sequenzähnlichkeit zeigten. Somit ist auf diesem Wege das Vorkommen der Sequenzen im Transkriptom (cDNA), eine relative Quantifizierung auf Transkriptomebene (cDNA Microarray) und der Nachweis dafür erbracht, dass diese Sequenzen für Proteine kodieren (Peptididentifizierung). Innerhalb dieser Gruppe an potentiell unbekannten Proteinen konnten 17 signifikant konservierte Strukturen über eine entsprechende Mustersuche nachgewiesen werden. Some niche model organisms existing beside well established organisms like mouse, rat and drosophila, house fascinating skills that make them interesting for special research topics. One of these niche model organisms is the red spotted newt Notophthalmus viridescens. This organism is capable to completely regenerate complex structures without scarring. Beside appendage regeneration the newt regenerates the lens, parts of the central nervous system and also the heart. In contrast to mammalian hearts, responding by fibrosis and scarring after injury, newt cardiomyocytes are capable to dedifferentiate and proliferate after ventricular amputation or mechanical damage. By this process of dedifferentiation, proliferation and redifferentiation the function of the heart is rescued.Although there is some public transcriptome information available, only very few (less than 100 non redundant proteins) proteome information is given in public databases. This lack of sequence information has greatly impeded high throughput analysis of biological processes and identification of proteins playing a role in regeneration in the past. Even if nucleotide sequence data is available, it is often difficult to use these data for identification of proteins. These difficulties are amplified in particular, if EST clones lack obvious homologues in other species. Furthermore, it is sometimes complicated to distinguish open reading frames in EST clones without obvious homologues from 3 -UTRs, intermediate splice products or cloning artifacts.Nevertheless, here the generation and annotation of an normalized EST library is described. It was used to design a cDNA microarray. To unravel regulations on the transcriptome level during heart regeneration, a time course experiment on the regenerating heart was performed and analyzed.Additionally, the EST library was used in a first step to unravel the proteome of the newt since well annotated protein sequences are missing. Furthermore, it is shown that pulsed protein labeling with stable isotopes of amino acids (variation of pSILAC) improve peptide identification rates in EST libraries.Finally the development of a method enabling high throughput proteome analysis of the regenerating heart of the newt in vivo, based on a pulsed SILAC spike-in approach and a comprehensive use of a normalized cDNA library, is described.Since protein identification for the newt cannot base on newt protein sequences, a comprehensive cross database approach reveals more than 4000 non redundant protein identifications. Furthermore a group of 109 proteins based only on peptide identifications in amphibian species sequences was identified. This protein group is assumed to be exclusive for amphibian organisms since these sequences shows no significant homologies to non amphibian organisms.