Postconditioning protects endothelial cells from apoptosis during reperfusion injury : Role of inhibitor of apoptosis protein 2

Abstract

Postconditioning (intermittent hypoxia at the onset of reperfusion), a strategy known to effectively reduce reperfusion injury, is well proven in cardiomyocytes. However, little is known about postconditioning in endothelial cells and whether it plays a role in anti-apoptosis, which is the predominant form of cell death in endothelial cells. Here the protective effect of postconditioning in endothelial cells and the molecular mechanisms involved were studied, focusing on the inhibitors of apoptosis proteins (IAPs) as potential anti-apoptotic candidates induced by hypoxia. Exposure of human umbilical vein endothelial cells to severe hypoxia (Po2 greater than 1 mmHg) for 2 h caused a 2.1 ± 0.3 fold increase in caspase-3 cleavage, 6 h after reoxygenation and a 2.3 ± 0.2 fold increase in apoptosis (annexin V staining) 24 h after reoxygenation. Postconditioning abolished hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in endothelial cells. Quest for possible anti-apoptotic molecules led to the observation that cIAP2 but not its close homologue cIAP1 or XIAP, is upregulated during hypoxia and reduces to basal level with the onset of reoxygenation. Importantly, cIAP2 could be maintained by postconditioning in an ERK1/2 and PI3-Kinase dependant manner. Hypoxia as well as postconditioning induced an interaction between cIAP2 and procaspase-3 (co-immunoprecipitation and co-localization in immunochemistry), suggesting a mechanism by which cIAP2 counteracts hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis. Downregulation of cIAP2 with siRNA enhanced hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis and abolished the protective effect of postconditioning. Maintenance of cIAP2 by postconditioning in the intact vessel confirms the patho-physiological significance of the finding. The present study shows for the first time that postconditioning can protect endothelial cells against hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis. This protective effect is conferred by the cIAP2, which is expressed during hypoxia and could be maintained at an elevated level by postconditioning, interacting with procaspase-3. Postkonditionierung (Phasen intermittierender Hypoxie zu Beginn einer Reperfusion) ist eine wirksame Strategie, die das Ausmaß des kardiomyozytären Reperfusionsschadens reduzieren kann. Es ist jedoch unklar, welche Wirkung die Postkonditionierung auf die endotheliale Apoptose hat, welche die vorherrschende Form des Zelluntergangs darstellt. Ziel dieser Arbeit war es daher, die protektive Wirkung der Postkonditionierung und die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen in Endothelzellen zu untersuchen. Der Fokus lag dabei auf einer Familie Apoptose-inhibierender Proteine (Inhibitors of Apoptosis Proteins, IAPs) als potentielle anti-apoptotische Kandidaten, die durch Hypoxie induziert werden. Humane Endothelzellen aus Nabelschnurvenen, die einer zweistündigen Hypoxie (Po2 greater than 1 mmHg) ausgesetzt wurden, zeigten nach sechstündiger Reoxygenierung einen 2,1 ± 0,3-fachen Anstieg der Caspase 3-Aktivität (Westernblot) und nach 24 Stunden Reoxygenierung eine 2,3 ± 0,2-fache Steigerung der Apoptoserate (Annexin V-Färbung). Postkonditionierung im Anschluss an die zweistündige Hypoxie reduzierte die Hypoxie/Reoxygenation (H/R)-induzierte Apoptose. Die Suche nach möglichen antiapoptotischen Molekülen ergab, dass der zelluläre Gehalt an cIAP2, nicht jedoch der von cIAP1 oder XIAP, während Hypoxie anstieg. Mit Einsetzen der Reoxygenation sank der cIAP2-Gehalt wieder auf das Ausgangsniveau. Durch Postkonditionierung konnte ERK1/2- und PI3-Kinase-abhängig der cIAP2-Gehalt auf dem post-hypoxischen Niveau gehalten werden. Hypoxie sowie Postkonditionierunng induzieren die Interaktion zwischen cIAP2 und Pro-Caspase 3 (Co-Immunoprezipitation bzw. Co-Lokalisation im immunzytologischen Nachweis). Die gezielte Herunterregulation von cIAP2 durch Einsatz von siRNA führte zu einer Verstärkung der H/R-induzierten Apoptose und hob die protektive Wirkung der Postkonditionierung. Die Aufrechterhaltung von cIAP konnte in Untersuchungen an intakten Gefäßen bestätigt werden. Die vorliegende Arbeit erstmalig, dass Postkonditionierung Endothelzellen vor einer H/R-induzierten Apoptose schützt. Dieser Effekt wird durch cIAP2 vermittelt, das während Hypoxie verstärkt exprimiert wird und dessen Konzentration durch Postkonditionierung auf dem posthypoxischen Niveau gehalten werden kann und mit Procaspase-3 interagiert.