Auswirkungen einer systemischen Hypertonie auf parakrine Effekte kardialer Progenitorzellen

Abstract

Viele wissenschaftliche Untersuchungen und klinische Experimente konnten injüngster Zeit die funktionsverbessernden Wirkungen von kardialen Stammzellen und Progenitorzellen, vorwiegend auf das erkrankte Herz, beweisen. Die exakten Mechanismen dieser positiven Beeinflussung sind bis dato weitestgehend ungeklärt. Diese Studie gab uns die Möglichkeit, die parakrinen Effekte adulter kardialer Progenitorzellen (CPC) in Hinblick auf das Management des kranken Herzens zu untersuchen. Die Progenitorzellen wurden aus Herzgewebe von normotensiven Wistar Ratten (WIS), spontan hypertensiven Ratten (SHR) sowie von Menschen gewonnen, wobei bei Letzteren eine Zuordnung zu Gruppen von Hypertonikern und Nichthypertonikern erfolgte. Dabei wurden im Zuge der Kultivierung die konditionierten Überstände der Progenitorzellen gewonnen und in anschließenden Versuchen auf ihre Einflüsse hinsichtlich des Remodelings und der kardialen Funktion von isolierten Kardiomyozyten und Ganzherzen analysiert. Bei dem Großteil der Untersuchungen standen die kardialen Progenitorzellen und deren Überstände am Ende der sechswöchigen Kultivierungsphase im Fokus. Zu diesem Zeitpunkt gewonnene konditionierte Überstände wurden zusammen mit ihren unkonditionierten Kontrollen in den Experimenten zur Untersuchung der kardialen Funktion und des Remodelings verwendet.Die Charakterisierung ex vivo generierter Progenitorzellen erfolgte anhand von typischen kardialen Markern und Stammzellmarkern, welche durch Western Blot, RT-PCR und Immunfluoreszenz nachgewiesen werden konnten. Zudem wurde in den Zellen das Auftreten von spontanen Calciumtransienten überprüft. Versuche, in denen konditionierte Überstände kardialer Progenitorzellen für 24 Stunden mit isolierten Kardiomyozyten inkubiert wurden, zeigten eine signifikante Verbesserung der kontraktilen Funktion, was auf zellulärer Ebene auf einen ebenfalls nachgewiesenen Anstieg des Serca 2a/NCX-Verhältnisses (Indikator für verbessertes Calciumhandling) zurückzuführen ist. Auf gleiche Weise behandelte Kardiomyozyten zeigten im Hoechst-Assay eine Verminderung der Apoptoserate, was wiederum durch einen signifikanten Anstieg des Bcl-2/Bax-Verhältnisses (Überwiegen des anti-apoptotischen Effekts) verursacht wird. In beiden Versuchen konnte eine Verstärkung des Effekts bei Verwendung von Überständen von SHR im Vergleich zu WIS sowie in Versuchen mit Kardiomyozyten von SHR gezeigt werden. Generell konnte eine erhöhte Ansprechbarkeit isolierter Kardiomyozyten von SHR auf die konditionierten Überstände von SHR ermittelt werden. Diese Überstände wurden für Ischämie-Reperfusions-Versuche im Langendorff-Modell mit Herzen von WIS und SHR verwendet. Hierbei konnte in beiden Gruppen eine Verbesserung der Postinfarkt-Erholung (Recovery) und in den SHR Herzen eine erhöhte mRNA Expression des Bcl-2 im Verhältnis zu Bax beobachtet werden. Die Untersuchungen zur Auswirkung auf die kontraktile Funktion wurden auch mit Überständen von humanen Progenitorzellen durchgeführt, wobei deren Spender vor dem Hintergrund ihres Blutdruck-Status bewertet wurden. Hierbei ergab sich wiederum ein signifikanter Anstieg der kontraktilen Funktion bei der Gruppe der Nichthypertoniker, welcher bei der Gruppe der Hypertoniker sogar hoch signifikant ausfiel. Bei der Zusammenfassung aller Versuche mit humanen Progenitorzellen wird eine deutliche Korrelation zwischen dem Status der Hypertonie und der Verbesserung der kontraktilen Funktion von isolierten Kardiomyozyten ersichtlich. Bei der Zytokin-Analyse der Überstände konnten in den verschiedenen Gruppen deutliche Unterschiede in der Zusammensetzung und Konzentration der freigesetzten Zytokine beobachtet werden. Besonders auffällig waren hierbei die Zytokine IL-6, welches von den SHR Progenitorzellen im Vergleich zu WIS vermehrt sezerniert wurde, sowie MIP-3α und TNF-α, welche von SHR vermindert sezerniert wurden. In den humanen Überständen aus Progenitorzellen von Hypertonikern wurden die Zytokine IL-6, IL-8, MCP-1, MMP-1 und TIMP-1 vermehrt sezerniert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass kardiale Progenitorzellen in der Lage sind, die kardiale Funktion und das Remodeling des Herzens durch parakrine Mechanismen zu verbessern. Die Ausprägung der Effekte wird hierbei sowohl durch den Donor als auch den Empfänger der konditionierten Überstände beeinflusst. Diese Phänomene sind wiederum sowohl auf das unterschiedliche parakrine Profil (Zytokincocktail) der Progenitorzellen (Donor) als auch die auf die Konstitution des untersuchten Materials (Empfänger) zurück zu führen. In beiden Fällen nimmt also der Status der Vorerkrankung einen ausgeprägten Einfluss auf das Geschehen. Diese Erkenntnisse stellen ein Schlüsselelement zukünftiger Forschungen dar und ermöglichen somit eine gezielte Untersuchung von Signaltransduktionswegen und Mechanismen, um das Potenzial der Zytokine in der gezielten Behandlung kardialer Erkrankungen ausnutzen zu können. A numerousness of scientific investigations and clinical trials in the recent past could prove the function-improving impacts of cardiac stem cells and progenitor cells, predominantly with regard to the diseased heart. The exact mechanisms of these positive influences are as far as possible not yet resolved. This study gave us the possibility to examine the paracrine effects of adult cardiac progenitor cells (CPC) interms of the management of the failing heart.The progenitor cells were gained from heart tissue of normotensive Wistar rats (WIS), spontaneous hypertensive rats (SHR) and of humans, whereas at the latter anallocation to groups of hypertonic patients and non-hypertonic patients was carried out. In the course of the cultivation, conditioned supernatants from progenitor cells were gained and used in subsequent experiments for analyses of remodeling and cardiac function of isolated cardiomyocytes and isolated hearts. The bulk of trails focused on the progenitor cells and their supernatants at the end of the six-week culture period. Supernatants that where gained at this point in time were, together with their unconditioned controls, used in analyses of cardiac function and remodeling.The characterisation of the ex vivo generated progenitor cells took place by means of typical cardiac markers and stem cell markers, which could be detected by western blotting, RT-PCR and immunostaining. Furthermore, the occurrence of spontaneous calcium-transients in these cells was verified.Trials, in which conditioned supernatants of cardiac progenitor cells were incubated for 24 hours with isolated cardiomyocytes, showed a significant increase incontractile function, which is on cellular rank due to a likewise proved rise of the Serca 2a/NCX-ratio (indicator for improved calciumhandling). Cardiomyocytes that were treated in a similar manner showed a decreased rate of apoptosis in Hoeassays, which in turn is caused by a significant increase of the bcl-2/bax-ratio (preponderance of the anti-apoptotic effect). In each case by using supernatants from SHR or cardiomyocytes from SHR an amplification of the observed effect in comparison to those from WIS occurred. Generally, a higher receptiveness of isolated cardiomyocytes from SHR to the conditioned supernatants from SHR couldbe ascertained. These supernatants from SHR were used in Langendorff-ischaemiareperfusion-tests with isolated hearts from WIS and SHR. In this connection in both groups, an amelioration of the post-infarct-recovery and an increased mRNA-expression of Bcl-2/Bax-ratio in SHR-hearts could be noticed.The impact studies on the contractile function were also carried out with supernatants from human progenitor cells, at which their donors were stated at the background of their hypertension. At this again a significant increase of contractile function in the group of non-hypertonic patients was observed, which increased in the group of hypertonics to a high significant level. Summing up all the results from humanprogenitor cells, a marked correlation between the status of hypertension and the increase of the contractile function of isolated cardiomyocytes becomes evident. By performing cytokine-analysis of supernatants remarkable differences incomposition and concentration of released cytokines could be observed. In particular noticeable were the cytokines IL-6, which was augmented produced from SHRprogenitor cells in comparison to WIS and MIP-3α and TNF-α, which were diminished in supernatants from SHR. In human supernatants from progenitor cells of hypertonic patients the cytokines IL-6, IL-8, MCP-1, MMP-1 and TIMP-1 were produced in larger quantities. In summary, cardiac progenitor cells have the ability to ameliorate the cardiac function and remodeling of the heart by acting via paracrine mechanisms. The value of the effects is at this juncture influenced by the donor as well as by the receptor of the conditioned supernatants. These phenomenons are again caused by the variable paracrine profile (cytokine-cocktail) of the progenitor cells (donor) on the one hand and due to the condition of the observed material (recipient) on the other hand. In both cases the status of the pre-existing conditions exerts a distinct influence on the event. These findings pose a main element of prospective researches and therefore enable the selective investigation in mechanisms and paths of signal-transduction to take advantage of the potential of cytokines in the well-directed treatment of cardiac diseases.