Untersuchungen zur GOT1 als Kandidatengen für die Variabilität der Serum-Aspartat-Aminotransferase-Spiegel beim Schwein

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen Beitrag zum Verständnis der molekularen Basisder Variabilität klinisch-chemischer Merkmale am Beispiel der Serum-AST (sAST) zuleisten. Die signifikante Variation der sAST bei verschiedenen Rassen ist hinreichend bekanntund kann bei Nichtbeachtung zu diagnostischen Fehlinterpretationen führen. Die Ursache fürdiese Variation ist allerdings unklar; vermutet werden Unterschiede in der Freisetzungskinetikdes Enzyms aus geschädigten Zellen. In einem Vorversuch zu vorliegender Arbeit wurde einQTL für sAST im Bereich des verantwortlichen Gens (der GOT1) kartiert. Hieraus ergibt sichdie Möglichkeit, dass die Variation der sAST zumindest teilweise auf der qualitativen oderquantitativen Wirkung des Gens selbst beruhen könnte, basierend auf begünstigenden oderhemmenden Genvarianten. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, die Variabilität der GOT1auf Sequenzebene zu untersuchen und Assoziationen zwischen Genvarianten und sASTSpiegelnherzustellen, um den Kandidatengenstatus der GOT1 für sAST zu bestätigen undHinweise auf das für den QTL verantwortliche Nukleotid (QTN) zu erhalten. Da weder diegesamte Sequenz der porzinen GOT1 noch Genvarianten bekannt waren, wurden diesezunächst durch vergleichende Sequenzierung an DNA der Rassen Pietrain und Meishanerarbeitet. Von neun identifizierten SNPs wurden drei im Bereich von Exon 2 und die übrigenim Bereich des Promotors lokalisiert. Für jeden der SNPs wurde ein Screening-Verfahrenmittels Pyrosequenzierung etabliert und auf die F2-Tiere einer gut charakterisierten Pietrain-Meishan-Familie sowie auf eine kommerzielle Kohorte (Jungsauen DLxDE) angewandt. Zweider SNPs führten zu einer signifikanten Verbesserung des QTL. Das Konfidenzintervall desQTL wurde erheblich reduziert. Die Assoziation der 139 Tiere der F2-Generation ergab einensignifikanten Zusammenhang zwischen SNP1-Genotyp und sAST-Werten (CC (Meishan),hohe sAST-Werte; GG (Pietrain), niedrige sAST-Werte). In der ausgezüchteten,kommerziellen Population von 153 Hybridsauen zeigte sich diese Assoziation ebenfallssignifikant, allerdings mit umgekehrter Kopplung. Die vorliegende Arbeit untermauert damitden Kanidatengenstatus der GOT1 für die Variabilität der sAST Werte. Die etablierten SNPskönnen jedoch aufgrund der Diskrepanz der Ergebnisse der F2-Population und derkommerziellen Population als QTN-Kandidaten ausgeschlossen werden. Die Einflüsse derSNPs auf den QTL sprechen dafür, das das verantwortliche QTN noch weiter 5´ zu suchen ist.Die Ergebnisse untermauern außerdem die Komplexität der Serum-Diagnostik und dieNotwendigkeit, die gefundenen genetischen Einflüsse in Folgeuntersuchungen zuuntermauern. Die vorliegende Arbeit zeigt neue Einblicke in die Architektur klinisch-chemischer Merkmale. Sie zeigt Hinweise auf komplexe molekulare Zusammenhänge, dieerst allmählich verstanden werden, und die mithelfen können, die Entstehung und dieVariabilität klinisch-chemischer Merkmale zukünftig zielgerichteter und verlässlicherinterpretieren und einsetzen zu können. Aim of the present study was to elucidate the molecular basis of the variation of clinicalchemicaltraits using the example of AST. The significant variation of serum AST (sAST)between different breeds is already known and has to be considered during the interpretationof clinical test. The reason for the variation is not known but it can be supposed that there aredifferences in the kinetic of enzyme release of damaged cells. In the preliminary data for thisstudy there is a QTL for sAST in the area of the corresponding gen (GOT1) mapped. Fromthis we concluded, that there is the possibility that the variation of sAST is partial based onqualitativ or quantitative effects of the gen itself based on promotive or inhibitorygenvariations. Aim of the research was therefore to examine the variability of GOT1 onsequence level and to search for associations between genvariants and levels of sAST toconfirm the candidate-status of GOT1 for sAST and to further localize the nucleotid, that isresponsible for the QTL (QTN). But neither the sequence of the porcine GOT1 nor variationsof it were known. We established the sequence and discovered SNPs of it through thecomparison of the sequenced DNA of the Meishan and Pietrain breed. Nine SNPs wereidentified, three of them in the area of Exon 2 and the others in the area of the promotor. Foreach SNP we established a screening method (Pyrosequencing) and analyzed the F2-Generation of the well-described Pietrain-Meishan-Family and a commercial cohort (giltGerman Landrace x German Edelschwein). Two SNPs produced a significant improvement ofthe QTL and resulted in a significant reduction of the confidance intervall for the QTL. Therewas a significant association between SNP1-Genotype and sAST-Levels in the139 animal ofthe F2-generation (CC(Meishan) results in high AST-levels, GG(Pietrain) low AST-levels). Inthe commercial population of the 153 hybrid-sows SNP1 was also significantly associatedwith sAST-levels but with changed phase. This work verifies the relevance of GOT1 as acandidate-gene for the variance of the sAST-level. The newly established SNP has to beexcluded as possible QTN-candidate due to the conflicting results in the Pietrain-Meishanfamily and the commercial population. Because of the influence of the SNP on the QTL it canbe concluded that the relevant QTN is located in 5 direction. This results elaborate thecomplexity of serum diagnostic and further underline the need for research on this topic. Thepresent study gives new insights into the architecture of clinical-chemical traits in pigs anddevelops a first understanding of the genetic backround.