Gentechnische Herstellung und Charakterisierung der Exotoxine Beta und Beta2 von Clostridium perfringens

Abstract

Zentraler Bestandteil der Bekämpfung C. perfringens-bedingter Durchfallerkrankungen von Ferkeln ist die Muttertierschutzimpfung mit Toxoidvakzinen. Da die zugelassenen Impfstoffe kein Beta2-Toxoid enthalten sind Neuentwicklungen unabdingbar. Eine Schlüsselrolle kommt der Herstellung der Toxine Beta und Beta2 zu, die für Wirksamkeitsnachweise, Pathogenitäts- und Immunisierungsstudien benötigt werden. Auf Grund ihrer besonderen Empfindlichkeit und der vielen Major- und Minortoxine, die C. perfringens-Wildstämme bilden, ist die heterologe, rekombinante Expression und affinitätschromatographische Aufreinigung zweckmäßig.Das Beta2-Toxin konnte mit dem pASK-IBA-Vektorsystem in E. coli TOP10F´ exprimiert und in SDS-PAGE, ELISA, Western und Immunblot nachgewiesen werden. Ein C-terminal mit einem Strep-Tag® II versehenes Beta2-Toxin aus dem Periplasma induzierter Klone wurde zur Gewinnung poly- und monoklonaler Antikörper genutzt, die natives Beta2-Toxin im Kulturüberstand von C. perfringens detektierten. Es besaß jedoch keine Aktivität im Mausmodell oder im Zellkulturversuch mit Caco-2- und IPEC-J2-Zellen. Daher wurden weitere Expressionsklone erzeugt. Doch auch durch Variation der Position des Strep-Tag® II Affinitätsanhängsels (C- bzw. N-terminal), des Expressions¬kompartimentes (Zyto- und Periplasma) und des Expressionswirtes (TOP10F´ und Rosetta-gami 2) gelang es in E. coli nicht, ein Beta2-Toxin mit toxischer Wirkung im Zell- oder Tierversuch zu gewinnen. In einem weiteren Ansatz wurde das Beta2-Toxingen einschließlich seines Signalpeptids mittels Plasmidvektor pHT01 auf den phylogenetisch näher mit C. perfringens verwandten Expressionsstamm B. subtilis WB800N übertragen. Die Sequenz des rekombinanten Beta2-Toxins entsprach exakt der des Wildtyp-Toxins aus C. perfringens. Die Expressionsbedingungen waren auf Produktschonung des temperatur- und sauerstoffempfindlichen Produktes ausgerichtet. Dennoch waren Beta2-Toxin-haltige Konzentrate des Kulturüberstandes für Caco-2 und IPEC-J2-Zellen atoxisch.Das Beta-Toxin-Gen cpb wurde mit Vektor pASK-IBA5plus ligiert und das resultierende Plasmid pHIT-VIc-42 auf E. coli TOP10F´ übertragen. Nach Induktion des Expressionsklons konnte das rekombinante Beta-Toxin mit N-terminalem Strep-Tag® II aus Ganzzelllysaten affinitätschromatographisch aufgereinigt und in SDS-PAGE, ELISA und Western Blot dargestellt werden. Nach intraperitonealer Applikation war es toxisch für BALB/c- und NMRI-Mäuse. Für letztere wurde eine halbletale Dosis von 78 µg/kg bzw. 1,56 µg/Tier ermittelt. Die letale Wirkung war damit im Vergleich mit einem aus C. perfringens-Kulturüberständen gewonnenen Toxin reduziert, was vermutlich auf das Affinitätsanhängsel zurückzuführen ist. Drei rekombinante Beta-Toxine anderer Arbeitsgruppen zeigten in Anwesenheit eines Affinitätsanhängsels keine Aktivität.Erstmalig wurde somit ein fusioniertes, biologisch aktives Beta-Toxin erzeugt, das für Neutralisationsversuche im Rahmen der Impfstoffzulassung zur Verfügung steht. Die gewonnenen Beta2-Toxin-Varianten besitzen keine biologische Aktivität obwohl sie sich sequentiell vom nativen Toxin aus C. perfringens nicht bzw. lediglich durch das angefügte Affinitätsanhängsels unterscheiden. Sie können zur Herstellung von Antikörpern und als Impfantigen genutzt werden. A central element for prevention and control of C. perfringens associated diarrhoea in piglets is the vaccination of pregnant sows with toxoid vaccines. Because none of the commercial vaccines contains Beta2 toxoid new developments are indispensable. The production of the two toxins Beta and Beta2, which are needed for efficacy testings, pathogenicity and immunization studies, is of great importance. Because of their high sensitivity and the numerous major and minor toxins which are produced by C. perfringens wild-type strains, the toxins were to be overexpressed in E. coli and to be purified by affinity chromatography.The Beta2 toxin was expressed in E. coli TOP10F´ using the pASK-IBA vector system. Carrying a C-termial Strep-Tag® II, it was purified from the periplasm of induced clones. The recombinant Beta2 was detected in SDS-PAGE, ELISA, Western and Immunoblot and used to produce poly- and monoclonal antibodies. Unfortunately, it did not show any activity in the mouse challenge or in cell culture assays with Caco-2 and IPEC-J2 cells. Therefore, further expression clones were generated. But although the position of the Strep-Tag® II (C- and N-terminal), the expression compartment (cyto- and periplasm) and the expression host (TOP10F´ und Rosetta-gami 2) were varied, a Beta2 product with toxic effect in cell culture or animal trial could not be obtained.In another approach the Beta2 toxin gene with its original signal peptide was introduced into the B. subtilis expression strain WB800N, which is phylogenetically more closely related to C. perfringens then E. coli, using plasmid vector pHT01. The sequence of the recombinant Beta2 toxin was consistent with that of wild type toxin from C. perfringens. The terms of expression were adapted to preserve the temperature and oxygen sensitive product. Nevertheless, concentrates of culture supernatants containing the Beta2 toxin were non-toxic for Caco-2 and IPEC-J2 cells.The Beta toxin gene cpb was ligated with vector pASK-IBA5plus and the resulting plasmid pHIT-VIc-42 was introduced into E. coli TOP10F´. After induction of the expression clone, the recombinant Beta toxin with its N-terminal Strep-Tag® II was purified from whole cell lysates via affinity chromatography. Beta toxin was detectable in SDS-PAGE, ELISA and Western blot and showed toxic activity in BALB/c- and NMRI-mice after intraperitoneal application. For NMRI-mice a median lethal dose of 78 µg/kg or 1.56 µg/animal was calculated respectively. The lethal effect was reduced compared to toxin from C. perfringens culture supernatants, probably due to the affinity tag. Three Beta toxins from different work groups showed no activity in presence of an affinity tag, so that this is the first time that a fused, biologically active Beta toxin was generated, which is available for neutralization assays within the scope of vaccine approvals.